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随着世界人口增长和对粮食需求的增加,高产、稳产、资源利用高效是未来农业发展及小麦生产的必经之路,创制抗病以及肥料高效的小麦新种质尤为重要。远缘杂交和染色体工程是利用外源基因拓宽小麦遗传基础的有效途径,来自近缘野生种的基因(染色体片段)在小麦抗病性、丰产性、耐逆性的改良中发挥了重大作用。 二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum,2n=2x=14,EE)是小麦的一个近缘野生种,携带有许多抗生物胁迫与耐非生物胁迫的优良基因,在小麦遗传改良中具有重要利用价值与潜力。为了能够更好的发挥该野生种在小麦遗传改良中的作用,本论文从两个方面展开研究。第一方面,借助高通量测序、生物信息学、比较基因组学以及HRM和KASP基因型鉴定等手段,高通量开发长穗偃麦草1E-7E染色体特异的SNP分子标记,其中对6E染色体特异的SNP标记进行了更为详细的研究,并利用开发的SNP标记检测普通小麦背景中长穗偃麦草片段的渗入。第二方面,对中国春/长穗偃麦草6E附加系(CS/6E)幼苗在低磷胁迫处理下的差异表达基因进行了分析,为研究其耐低磷机制提供基础数据。主要结果如下: 1、通过对普通小麦中国春(Chinese Spring,2n=6x=42,AABBDD)以及中国春/长穗偃麦草八倍体(CS/Th.elongatum octoploid,2n=8x=56,AABBDDEE)地上部组织进行454转录组测序,结合生物信息学以及比较基因组学分析方法,挖掘了Th.elongatum与普通小麦直向同源基因之间的SNP位点,并进行1E-7E染色体特异SNP标记的开发以及应用。 (1)挖掘了35,193个位于Th.elongatum与普通小麦中国春直向同源基因之间的SNP位点,并根据Th.elongatum与普通小麦之间的染色体共线性,初步将这些SNP位点分配至1E到7E各条染色体上。 (2)从上述开发的35,193个SNP位点中,随机选取了420个,利用高分辨率熔解(HRM)基因分型方法,将373个位点成功转化为E染色体特异的SNP标记,成功率为90%,并且实验证明,染色体定位以及长、短臂的定位与预测相一致。 (3)从中选择了14个标记,即每条染色体2个,长臂与短臂各1个,检测了80个“济麦22×中国春/长穗偃麦草八倍体”远缘杂交衍生的F2单株中偃麦草片段的渗入情况,在78个单株中检测到整条或者部分偃麦草片段。其中,材料F2-77含有一条6E与7E形成的重组染色体,这些将为小麦育种提供新的种质资源。 2、对CS/6E在正常营养条件以及低磷胁迫条件下,地上部与根部组织分别进行了转录组测序。通过对测序数据进行分析,一方面开发了6E染色体特异的SNP标记,另一方面分析了6E染色体基因对低磷胁迫的响应。 (1)对低磷胁迫条件下CS以及CS/6E的一些生理指标进行了测定。在低磷处理一段时间后,CS由于花青苷的积累,茎呈现紫红色,地上部干重约减少31%,而CS/6E并没有明显变化;与正常营养条件相比,CS根冠比增加了3.68倍,而CS/6E增加了0.97倍;CS/6E地上部与根部每克组织中磷的含量分别是CS的1.41倍和1.20倍。这些结果初步表明,与CS相比,CS/6E对低磷胁迫有较好的耐性。 (2)挖掘了9,247个位于6E染色体与中国春直向同源基因之间的SNP位点。利用直接测序法和KASP基因分型方法进行验证,阳性率约为95%。 (3)根据上述得到的6E特异的SNPs,将6E染色体特异的reads提取出来进行de novo拼接,得到1,241个源予6E染色体的转录本(基因)。 (4)对这1,241个源于6E染色体的基因,进行正常营养条件以及低磷胁迫条件下的差异表达分析,结果发现,地上部有538个差异表达基因,其中上调表达248个,下调表达290个;根部有403个差异表达基因,其中上调表达200个,下调表达203个。 (5)从这些差异表达基因中,选择了源于6E的柠檬酸合酶基因(TeCS)以及无机焦磷酸酶基因(TeIPP1)进行序列克隆、定位以及表达分析。TeCS定位在6ES上,与对照相比,低磷胁迫条件下,地上部上调表达2.8倍,根部上调表达1.8倍;而TeIPP1定位在6EL上,低磷胁迫条件下,地上部上调表达5.7倍,根部上调表达4.7倍。 综上所述,本研究利用生物信息学、比较基因组学以及HRM和KASP基因型鉴定等手段,开发了Th.elongatum染色体特异的SNP标记,分析了6E染色体上受低磷胁迫诱导的差异表达基因,为利用Th.elongatum进行小麦育种提供了丰富的分子标记,尤其是为选育耐低磷小麦品种提供了理论依据和基因资源。