宇佐美曲霉木聚糖酶基因的改造及表达

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宇佐美曲霉(Aspergillus usamii木聚糖酶(XynII)是G/11家族高比酶活木聚糖酶的一种,来源于Thermomonospora fusca的木聚糖酶(TfxA)也属于G/11家族的耐高温木聚糖酶。本研究以XynII为母体通过与TfxA N端替换拟提高XynII的耐热性。结果表明,N端替换后的重组蛋白XynIIAB失去了木聚糖酶活性;比较XynII、TfxA和XynIIAB的三维结构,发现XynII和TfxA空间位置第6位氨基酸残基都是芳香族氨基酸(Tyr或Phe),但在XynIIAB中失去了这一空间位置。为考察第6位芳香族氨基酸对酶活性的影响,设计实验将XynII第6位酪氨酸定点突变为丝氨酸(Ser)。研究结果发现,突变后的重组蛋白XynIIY6S同样无木聚糖酶活性;进一步对已报道的20种G/11家族木聚糖酶进行三维建模,发现它们在上述的空间位置都是芳香族氨基酸。由此可见,XynII无论是N端替换或定点突变,由于均失去了空间位置上保守的Tyr或Phe,从而导致酶活性的丧失。对宇佐美曲霉木聚糖酶XynII进行S179C定点突变。测定结果表明,突变酶XynIIs179c的最适反应温度由原酶的50℃提高到52℃;50℃热处理,半衰期由原酶的23min延长到70 min,热稳定性是原酶的3倍;最适反应pH无变化。
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