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抗菌肽(Antibacterial peptides,ABP)是生物机体为对抗外源性病原体及恶性细胞,由免疫防御系统非专一性应答产生的一类小分子活性肽的总称。抗菌肽通常是由10-50个氨基酸组成的小分子多肽,具有抗菌谱广、热稳定性强、分子量小及免疫原性小等特点,其杀菌机制独特,不易产生耐药菌,有望开发为新一代肽类抗生素。两栖类动物的生活环境复杂多样,而且皮肤湿润、裸露,与各种微生物密切接触,为外界微生物的入侵创造了便利条件。于是为了防御外界病原菌的侵袭,它们依靠皮肤腺体分泌出一系列抗菌肽。国外学者对两栖类皮肤分泌物的研究已经有四十多年,目前已有500多种抗菌肽被报道,不同物种的皮肤可以分泌不同种类的抗菌生物活性分子。迄今为止,已经通过测定得到了多种抗菌肽的氨基酸序列,并且对其结构和功能进行了较为详细的研究。研究结果表明,两栖类皮肤多肽目录呈现出超乎想象的分子和功能多样性。蛙科(Ranidae)是无尾目的第三大科,其分布几乎遍及各大洲,它们皮肤抗菌肽的种类和数量极其惊人,这意味着对其进行研究有着巨大的价值。在本实验室前期工作中,从东北林蛙皮肤中鉴定得到一种新型抗菌肽Dybowskin-2CDYa(收录号:EU827809),此抗菌肽由18个氨基酸残基组成,预测分子量为2154.2,等电点为12.60,带有10个正电荷。其具有正电荷较多;C末端不进行酰胺化修饰;等电点较高,为强碱性多肽;亲水性强等不同于其他抗菌肽的理化性质。根据该肽特点和结构预测分析可知,Dybowskin-2CDYa为一类对细菌膜有高亲和性的阳离子a-螺旋抗菌肽,推测其可能具有较强的抗菌活性。目前,获得大量抗菌肽的最佳方法是基因工程法,主要有大肠杆菌、毕赤酵母、植物、昆虫几种表达系统,其中原核表达系统是第一个也是应用最广泛的抗菌肽表达系统。由于抗菌肽对原核细胞的强毒性,一般采用是在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达抗菌肽。采用融合表达能够提高抗菌肽表达水平,中和其碱性避免酶降解并通过以没有活性的包涵体方式表达来减少其对原核宿主的毒性,增加表达物稳定性。同时,表达出来的融合蛋白中具有许多便于分离纯化的特异性标签。人表皮生长因子(hEGF)是促生长因子家族成员之一,能够强有力的促进细胞增殖分化,是上皮细胞、表皮细胞和间充质等敏感细胞的丝裂原。迄今,hEGF重组蛋白被广泛用于皮肤烫伤烧伤、角膜损伤及胃溃疡等方面且效果明显。在新生血管形成、促进表皮细胞的增殖以及刺激神经细胞分化等方面具有显著的作用,因此可用于治疗创伤、烧伤以及加速伤口愈合等疾病。为了获得新型抗菌肽Dybowskin-2CDYa的稳定表达,利用大肠杆菌对抗菌肽Dybowskin-2CDYa和人表皮生长因子hEGF进行融合表达,并研究融合蛋白的抗菌活性,进而为下一步研究融合蛋白的皮肤修复功能奠定基础。本实验首先根据大肠杆菌密码子偏好性,设计东北林蛙抗菌肽Dybowskin-2CDYa和人表皮生长因子hEGF融合肽的基因序列,通过SOE-PCR方法获得完整基因片段后,与原核表达质粒pET-30a(+)连接构建重组表达质粒。经测序分析,质粒序列与设计吻合,读码框无误。后将pET30-hEGF-Dybowskin-2CDYa重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),构建融合蛋白的原核表达系统,载体引物进行PCR验证正确后,利用IPTG诱导融合蛋白的表达。对表达产物进行12%SDS-PAGE蛋白电泳分析,结果显示在蛋白标准品14.3KDa位置左右有目的条带出现,进行Western Blot鉴定后确定了融合蛋白的表达。然后,溶解没有活性的融合蛋白包涵体,先利用镍离子金属螯合亲和层析方法分离纯化,再经过透析袋除盐和复性后,检测融合蛋白的抑菌活性,结果显示融合蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制活性。本文研究结论:通过SOE-PCR获得抗菌肽Dybowskin-2CDYa和hEGF融合肽基因序列,成功构建融合肽的原核表达重组质粒pET30-hEGF-Dybowskin-2CDYa。利用IPTG诱导构建好的融合蛋白原核表达菌株,成功获得稳定表达的融合蛋白。融合蛋白经过镍离子金属螯合亲和层析分离纯化后,SDS-PAGE检测纯化蛋白。纯化蛋白复性后进行抑菌活性实验,显示出对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌良好的抑制活性。本文为抗菌肽Dybowskin-2CDYa的结构功能及抑菌机制研究奠定了理论基础。