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研究背景： Nav1.1蛋白由SCN1A基因编码，SCN1A基因不同类型的突变可导致相应的Nav1.1蛋白结构和功能异常，进而改变神经元兴奋性，可以导致偏头痛、癫痫、孤独症等多种疾病的发生，而最常见的是癫痫。SCN1A基因的不同突变类型在热性惊厥附加症中的分布有一定的特点，其中GEFS+主要有错义突变，而PEFS+及SMEI包括多种突变类型：截短突变、错义突变、移码突变、剪接突变等，其中剪接位点突变或同义突变可能会导致pre-mRNA剪接过程中出现外显子缺失，从而生成Nav1.1蛋白缺失突变体。外显子编码区是决定氨基酸编码的DNA序列，当SCN1A基因某一外显子部分或完全缺失时，可引起Nav1.1蛋白部分序列丢失，进而对蛋白-结构-功能产生影响，甚至会引起严重的钠通道功能障碍，从而出现严重的癫痫表型：SME。本实验室已经发现3个引起SCN1A基因异常剪接的突变位点，包括c.909A>G、c.602+1G>A、c.4284+2T>C。其中，c.909A>G为外显子的同义突变，c.602+1G>A、 c.4284+2T>C为剪接位点突变，它们分别导致SCN1A基因6号外显子3’端的60个碱基缺失、4号外显子完全缺失和21号外显子完全缺失(Meng et al.，2013)，其相应的临床表型分别为：FS、SMEB、SMEI，且c.4284+2T>C患者合并有孤独症。本课题组前期使用体外minigene技术研究SCN1A基因突变引起的异常剪接，定量PCR检测发现：c.602+1G>A、c.4284+2T>C的正常转录本几乎不表达，以异常转录本为主（Meng et al.，2013），而c.909A>G仍有67.8％的正常转录本，仅有32.2%左右的异常转录本；上述异常转录本进一步表达的Nav1.1蛋白缺失突变体在HEK293T的亚细胞定位如何，它们能否正常运输到细胞膜以及AEDs处理对其细胞膜表达有无影响仍未知，值得进一步研究以探讨癫痫的致病机制及其与临床表型轻重的相关性。 研究目的： 比较Nav1.1野生型及其蛋白缺失突变体在HEK293T细胞中的亚细胞定位和表达模式以及AEDs对细胞膜Nav1.1蛋白表达的影响，阐述Nav1.1蛋白缺失突变体的可能致病机理及其与癫痫不同临床表型的相关性。 方法： 选取本实验室3个引起异常剪接的 SCN1A基因突变(c.602+1G>A、c.909A>G、c.4284+2T>C）作为研究对象。构建EYFP融合表达的Nav1.1野生型及其蛋白缺失突变体重组表达质粒，转染HEK293T细胞后，共聚焦显微镜观察Nav1.1野生型及其蛋白缺失突变体的亚细胞定位；分别使用PHT、LTG、VPA、TPM等AEDs药物处理，提取膜蛋白和总蛋白，进行Western blot以研究Nav1.1蛋白缺失突变体的表达模式，检测蛋白能否正常地运输到细胞膜，探讨抗癫痫药物对不同NaV1.1蛋白缺失突变体细胞膜表达的影响 结果： 1、共聚焦显微镜观察发现带有 YFP标签的 Nav1.1野生型与p.T303-R322del(c.909A>G)突变体在细胞膜和细胞浆都可看见强度较高的黄色荧光，p.T303-R322del突变体的细胞膜荧光强度与Nav1.1野生型比未见明显差异；而 p.Thr160_Tyr202del突变体(c.602+1G>A)和p.V1335_V1428del突变体(c.4284+2T>C)的细胞膜黄色荧光强度与Nav1.1野生型、p.T303-R322del比明显减弱，有统计学意义（P<0.001）。 2、Nav1.1蛋白及其缺失突变体提取总蛋白进行Western blot检测。采用光密度法半定量分析发现，p.Thr160_Tyr202del、p.V1335_V1428del突变体总蛋白表达水平均显著低于 Nav1.1野生型，且 p.V1335_V1428del突变体总蛋白表达比p.Thr160_Tyr202del低，有统计学意义（P＜0.05）；进一步提取膜蛋白进行Western blot检测发现p.Thr160_Tyr202del、p.V1335_V1428del突变体细胞膜蛋白表达水平同样低于Nav1.1野生型，有统计学意义（P＜0.05），而p.Thr160_Tyr202del突变体细胞膜蛋白表达水平与p.V1335_V1428del相比未见差异。另外，p.T303-R322del突变体在总蛋白及细胞膜蛋白表达水平均与Nav1.1野生型大致相同。 3、AEDs药物处理后提取膜蛋白进行Western blot检测发现，Nav1.1野生型在VPA和TPM药物处理后出现细胞膜蛋白表达升高，有统计学意义（P＜0.05），而PHT、LTG对Nav1.1野生型细胞膜蛋白表达无明显影响；p.Thr160_Tyr202del突变体在PHT和LTG处理后出现细胞膜蛋白表达明显下降，有统计学意义（P＜0.05），而VPA及TPM药物对其细胞膜蛋白表达无影响；另外，p.T303-R322del和p.V1335_V1428del突变体在上述4种AEDs药物处理后膜蛋白表达均未见明显变化。 结论： 1、Nav1.1蛋白缺失突变体蛋白表达水平可能与缺失氨基酸片段的长短及位置有关 2、Nav1.1蛋白缺失突变体中缺失氨基酸片段可能通过不同程度地影响蛋白的正确折叠、装配，改变蛋白的稳定性，导致启动的ERAD机制、细胞定位和运输至细胞膜表面存在差异性。 3、AEDs可能通过影响细胞膜蛋白表达影响癫痫治疗效果。