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目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)以长期慢性高血糖为发病基础,胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素抵抗为特征的一组代谢性疾病。随着经济的发展,人们生活方式的改变,糖尿病患病率显著增加。多种代谢紊乱会导致糖尿病血管内皮细胞功能障碍,从而引起一系列的糖尿病血管并发症,据统计糖尿病血管并发症已成为糖尿病致残致死的主要原因,因此保护血管内皮细胞对糖尿病患者具有重要意义。糖尿病血管并发症的发病机制主要包括多元醇通路、蛋白激酶C活化、糖基化终产物形成及其受体活化、己糖胺途径和氧化应激水平升高等,其中氧化应激被认为是始动环节及关键因素。因此本研究采用H2O2刺激内皮细胞制备氧化应激模型模拟糖尿病血管病变。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide 1,GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种肽类激素,通过葡萄糖依赖的方式作用于胰岛β细胞,促进胰岛素的生物合成和分泌。研究表明GLP-1还可刺激胰岛β细胞的增殖和分化,抑制胰岛β细胞凋亡,增加胰岛β细胞数量,同时还可抑制胰高血糖素的分泌、减少肝糖原的输出等。GLP-1不仅能够降低血糖、维持血糖稳定,还能抑制食欲,但是因其半衰期极短,易被体内二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidy1 proteaseⅣ,DPP-Ⅳ)降解,因此在临床应用方面受到了限制。GLP-1类似物及DPP-Ⅳ抑制剂克服了其半衰期短的缺陷,因此逐渐应用于2型糖尿病的临床治疗。近年来有研究表明GLP-1不仅能够降低血糖,维持血糖稳定,同时对心血管具有重要的保护作用,不仅可减轻血管的炎性损伤,其受体激动剂还可刺激内皮细胞增殖,对损伤的血管进行修复,但其对H2O2所致内皮细胞的损伤是否具有保护作用尚不清楚。因此,本研究以H2O2刺激原代培养的人脐静脉内皮细胞制备氧化应激细胞模型,观察经GLP-1(7-36)干预后是否能降低H2O2所致的内皮细胞损伤。方法:①人脐静脉内皮细胞分离培养:采用胶原酶灌注消化法分离人脐静脉内皮细胞,接种至包被有多聚赖氨酸的25cm2的培养瓶中,24h后更换培养液,以后每隔2d换液1次。当原代细胞融合85%-90%以上后,加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化,传代培养。第四代内皮细胞用于测定细胞活力。②人脐静脉内皮细胞的鉴定:应用兔抗人Ⅷ因子单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞进行免疫细胞化学染色,鉴定人脐静脉内皮细胞。③CCK-8法测定细胞活力:显微镜下观察,将长至大约70%的人脐静脉内皮细胞,随机分为5组,每组中分别加入0μM、100μM、200μM、400μM、800μM的H2O2,继续培养8、16、24 h,到达规定时间,于450nm处用多功能酶标仪测定各孔吸光度值,计算各组别细胞存活率,选定合适的刺激浓度及时间。⑤GLP-1(7-36)干预后CCK-8法测定细胞活力:将长至70%的内皮细胞随机分为对照组及刺激组,刺激组加入200μM的H2O2的同时分别加入0n M、100n M、200n M、400n M、800n M的GLP-1(7-36)孵育24小时,测定吸光度值,计算细胞存活率。⑤统计学方法:所有数据采用x±s表示。用SPSS 13.0软件进行数据处理,采用方差分析和独立样本t检验进行统计学分析,以P<0.05为有统计学意义。结果:1人脐静脉内皮细胞鉴定:兔抗人Ⅷ因子单克隆抗体免疫细胞化学染色,阳性反应物呈棕黄色,反应物分布于内皮细胞的胞质内。染色结果显示,第一代人脐静脉内皮细胞胞体饱满,呈梭形或多边形,细胞表面光滑,边界清楚。2细胞活力测定:不同浓度的H2O2刺激人脐静脉内皮细胞不同时间后,细胞活力明显降低(P<0.05),并且表现出一定的剂量依赖性,其中给予200μM H2O2刺激24h细胞存活率降低至67%。3给予GLP-(7-36)干预后内皮细胞的活力明显上升,从200n M GLP-1(7-36)干预浓度其具有统计学意义(P<0.05),并且表现出一定的剂量依赖性,其中200n M GLP-1(7-36)干预后细胞活力上升至88%。结论:1 H2O2刺激可引起内皮细胞活力明显下降,提示氧化应激引起内皮细胞损伤可能是DM微血管及大血管并发症的主要机制之一。2 GLP-1(7-36)可降低氧化应激所致的内皮细胞损伤,从而预防糖尿病并发症的发生。