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目的:研究蠲痹汤通过保护淋巴管回流功能免于炎症损害,以减少关节内炎性产物的累积,从而改善炎症性关节炎的机制;初步探索蠲痹汤中具有以上效应的有效成分;探讨保护淋巴回流功能是否为蠲痹汤治疗炎症性关节炎的作用靶点,为指导中医临床用药提供新的思路。 方法: 1.蠲痹汤对TNF-Tg小鼠淋巴管回流功能及关节炎的作用研究 以过表达肿瘤坏死因子alpha(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的转基因(Transgenic,Tg)小鼠(以下简称TNF-Tg小鼠)为动物模型,以蠲痹汤煎剂干预12周后,吲哚菁绿-近红外(indocyanine green-near infrared,ICG-NIR)淋巴回流功能检测系统(Olympus,MVX10),检测淋巴管回流功能,进行Micro-CT扫描及HE、ABHO、TRAP染色,观察踝关节距骨炎症浸润、骨和软骨侵蚀及破骨细胞的改变。 2.蠲痹汤冻干粉对淋巴管细胞的作用研究 使用TNF-α处理淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cell,LEC),在炎症刺激下,一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)高表达,产生一氧化氮(nitric oxide,NO),使用蠲痹汤冻干粉治疗,利用Q-PCR及Western blot,观察其对iNOS及NO产生的影响。将LEC与淋巴管平滑肌细胞(lymphatic vesselsmooth muscle cell,LSMC)共培养,检测NO对其功能标志物smα2,sm22α,平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,smhc),碱性调宁蛋白(h1-calponin)造成的损伤及蠲痹汤冻干粉对该损伤的效应,并做细胞凋亡及细胞周期检测药物安全性。 3.蠲痹汤有效单体成分的筛选及作用机制研究 采用NO测定实验筛选蠲痹汤的有效单体,检测该单体对LEC及LSMC的作用,并进一步进行体内实验验证。 结果: 1.蠲痹汤改善TNF-Tg小鼠淋巴管回流功能,减轻关节炎症 ICG-NIR检测显示,蠲痹汤治疗12周后,可促进淋巴管搏动次数及清除率的恢复;踝关节形态学染色显示,蠲痹汤可抑制炎症及破骨细胞,改善骨及软骨侵蚀。 2.蠲痹汤冻干粉抑制LEC产生NO对LSMC的损伤 HPLC显示,蠲痹汤冻干粉质量稳定;NO测定显示,蠲痹汤冻干粉可抑制炎症刺激下LEC产生过量的NO,Q-PCR及Western blot显示,蠲痹汤冻干粉可抑制iNOS的表达。在共培养条件下,蠲痹汤冻干粉可促进LSMC功能标志物的恢复,并无明显细胞毒性。 3.蠲痹汤有效单体对淋巴管平滑肌细胞的保护作用 通过NO测定,筛选出紫花前胡苷对iNOS具有抑制作用,并可通过改效应对LSMC起到保护作用。 4.紫花前胡苷促进TNF-Tg小鼠淋巴管回流功能恢复,改善关节炎症 紫花前胡苷治疗12周后,可促进淋巴管搏动次数及清除率的恢复并抑制炎症及破骨细胞,在一定程度上改善骨及软骨侵蚀。 结论: 1.蠲痹汤可治疗TNF-α高表达下踝关节炎症及骨侵蚀,其作用机制可能通过抑制LEC炎症下产生的NO对LSMC收缩功能的损伤,从而保证淋巴管对炎性物质的回流功能。 2.蠲痹汤的以上效应可能是通过羌活中的紫花前胡苷起作用,其他成分是否具有类似的作用及本方治疗关节炎症其他的作用机制有待进一步研究。