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研究背景:
马尔尼菲青霉病是一种由马尔尼菲青霉所引起的严重的深部真菌病，主要流行于东南亚地区，如泰国、越南、柬埔寨、老挝、香港和我国南方等地。该菌于1956年首次在越南野生竹鼠肝脏中分离发现，可从竹鼠等啮齿类动物体内及其洞穴的上壤中分离得到，但很难从其他自然环境中直接分离。目前尚未发现马尔尼菲青霉具有有性生活阶段，其无性生活阶段呈双相性牛长，双相性转变具有温度依赖性，25℃时呈菌丝相生长，37℃时呈酵母相牛长，感染人及动物时，以酵母相存在于宿主体内。马尔尼菲青霉感染常发生于有免疫缺陷的患者，尤其是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者。
近年来马尔尼菲青霉病流行区域有扩大趋势，发病率也逐渐上升，所以针对马尔尼菲青霉的相关研究也成为热点，虽然在马尔尼菲青霉的生物学、流行病学及致病机制等各方面的研究取得了很大进展，但仍有相当多的问题需要进一步的研究。在致病机制方面，有文献报道唾液酸可介导马尔尼菲青霉分牛孢子与板层素和纤维素的连接，这可能是马尔尼菲青霉侵入宿主气道不易被清除的机制之一。广西学者也通过组织染色及电镜观察到马尔尼菲青霉穿通血管壁的特性，并以此补充解释马尔尼菲青霉在体内广泛播散的机制。也有研究表明马尔尼菲青霉的双相性转变与其致病性存在着直接关系，尤其是酵母相可能与致病性密切相关。已有学者发现abaA基因、cflA基因、Ras和Rho RTase基因，在分生孢子的生成、菌丝相和酵母相的生长、细胞的极性化过程中起着重要的作用；gasA基因、cAMP／PKA与马尔尼菲青霉的发育及毒力相关；还有学者发现过氧化氢酶一过氧化物酶在马尔尼菲青霉的两相中表达存在差异，认为该酶在马尔尼菲青霉的致病过程中可能起着重要作用。马尔尼菲青霉病主要是由于马尔尼菲青霉分牛孢子经呼吸道进入宿主体内，随即被支气管、肺部的巨噬细胞所吞噬，如果宿主免疫系统存在缺陷，马尔尼菲青霉可在巨噬细胞内以酵母相细胞分裂增殖，进一步向全身播散。临床上常累及肺、肝、皮肤、骨髓等多个脏器，表现为发热、贫血、淋巴结炎、肝脾肿大及皮肤软疣样皮疹、脓疡等。病原菌进入宿主后被巨噬细胞吞噬并刺激机体氧化应激反应产生ROS(reactive oxygen species，氧活性簇)杀伤菌体。因此阐明病原性真菌如何躲避宿主产生的活性氧簇的杀伤作用是目前致病性研究的一个热点。需氧微生物存在一至几种抗氧化系统，过氧化氢酶家族是最重要、最普遍的系统。有文献报道过氧化氢酶家族存在三种瓦相之间有明显差异的酶基因亚家族：①锰过氧化氢酶，该酶只存在原核生物中；②双功能复合酶过氧化氢酶一过氧化物酶(catalase-peFOXidase，CpeA)；③单功能过氧化氢酶，又包括大亚基单位(80KD左右)和小亚基单位的过氧化氢酶(即过氧化物酶体的过氧化氢酶，peroxisomal-catalase，CatP，50~60KD)。
过氧化氢酶帮助菌体抵抗氧化应激反应及氧活性簇的杀菌作用，从而达到帮助菌在宿主体内存活的目的。我们前期蛋白质组学研究已经发现CpeA在酵母相表达较菌丝相升高，通过抑制消减杂交技术也发现过氧化氢酶在酵母相表达升高。在前期试验的基础上，我们进一步研究了过氧化氢酶家族部分成员在双相表达和巨噬细胞吞噬前后基因和／或蛋白水平的表达差异情况，以期进一步探讨过氧化氢酶家族与马尔尼菲青霉致病机制的相关性。
研究目的:初步推测过氧化氢酶家族与马尔尼菲青霉致病机制的可能相关性。
材料与方法:
1.菌株：马尔尼菲青霉SUMSO152株(已经形态学及DNA鉴定)，分离自一名血液病患儿的血液标本。
2.真菌培养：25℃(菌丝相)：在沙氏液体培养基振荡培养72h(150rpm)后用消毒滤纸收集；37℃(酵母相)：菌丝相菌株转种至脑心浸液固体培养基培养，每4天传代一次，诱导至镜下观察基本为酵母相细胞时，转种至37℃脑心浸液液体培养基振荡培养72h后收集；分生孢子：将菌接种于YMA培养基，25℃培养14d，用无菌生理盐水冲洗培养基表面，离心收取分生孢子，过滤除菌丝，无菌双蒸水清洗两遍，备用。
3.总RNA的提取和RT-PCR检测cpeA双相基因转录水平：使用Trizol试剂提取菌丝相和酵母相菌总RNA。利用设计好的cpeA引物，以总cDNA为模板，进行RT-PCR扩增。同时扩增内参照β-tubulin基因(管家基因，在多种细胞中稳定的高表达)。电泳成像后，软件分析两个条带的密度，以灰度比值衡量cpeA基因双相转录水平，并进行半定量比较。
4.巨噬细胞吞噬前后cpeA基因转录水平：诱导酵母菌和小鼠腹腔巨噬细胞共培养，收集吞噬后细胞内酵母菌，提取总RNA逆转录，进一步行Real-Time PCR检测吞噬前后cpeA基因转录水平(cpeA与β-tubulin引物序列同前RT-PCR)。
5.总蛋白的提取和Western-blotting检测CatP蛋白双相表达水平：以兔抗peroxisomal-catalase多克隆抗体作为一抗，鼠抗β-tubulin抗体为内参蛋白一抗，以辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体作为二抗。提取双相菌总蛋白后，进行Western-blotting。使用软件分析两个条带的密度，以CatP条带与内参条带灰度比值衡量CatP蛋白双相表达水平，进行半定量比较。
实验结果:
1.cpeA基因双相表达差异：
马尔尼菲青霉酵母相和菌丝相中均可检测到cpeA转录，酵母相和菌丝相表达水平灰度比值为2.485±0.356，t=9.337，P值<0.05。
2.Real-Time PCR检测巨噬细胞吞噬前后cpeA基因转录水平：
巨噬细胞吞噬后cpeA基因转录水平明显较吞噬前升高(平均值53.49：1)。
3.CatP蛋白双相表达差异：
P.marneffei两相均有CatP蛋白表达。Bandscan5.0软件分析各自的总灰度值，自身β-tubulin灰度值校正。统计学分析校正后酵母相／校正后菌丝相比值为4.87±0.94，t=-9.174，P值<0.05，差异有统计学意义。
结论:
1.过氧化氢酶家族成员cpeA基因和CatP蛋白在双相转化后在致病性的酵母相表达升高，可能与致病需要有关。
2.cpeA基因在巨噬细胞吞噬后表达升高，参与抗氧化反应，有利于菌在宿主体内存活，参与致病。