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硫酸头孢喹肟(Cefquinome Sulfate)由德国赫斯特公司(Hoechst AG)于二十世纪八十年代初开发的第四代动物专用头孢类抗生素,并于1993年首次批准上市。硫酸头孢喹肟具有抗菌谱广、抗菌活性强、药代动力学特征优良及毒副作用低等优点,已在欧洲、南美洲等开始用于兽医临床防治猪和牛的细菌感染性疾病。本项目依据《中华人民共和国兽药典》一部附录对“混悬型注射液”的规定,研制了硫酸头孢喹肟混悬注射液,并通过对该制剂的质量控制及稳定性、生物等效性、临床应用、残留消除规律等方面的研究,以期获得一种能和进口头孢喹肟具有同等生物效应的注射液,并最终能在我国兽医临床推广使用。1、硫酸头孢喹肟注射液的研制根据硫酸头孢喹肟的理化性质,进行了硫酸头孢喹肟注射液(2.5%)处方筛选和制剂生产工艺的研究。确定了制备硫酸头孢喹肟注射液时所用原料药的超微粉碎粒度、注射级大豆油溶媒及无菌充氮条件下混悬制备优化工艺；通过温度、光照对该混悬注射液的稳定性影响试验,建立了该制剂无菌制备工艺技术和20℃以下避光保存的贮藏条件。2、质量考察及稳定性、肌注刺激性试验通过性状监测、光照试验、分散性试验、沉降试验,判定硫酸头孢喹肟注射液为微细颗粒的混悬油溶液,久置分层,振摇后成均匀的类白色至淡黄色混悬液；经紫外-可见分光光度法扫描确定,头孢喹肟在265nm±2nm的波长处有最大吸收。根据头孢喹肟在碱性条件下与羟胺作用生成的羟肟酸,在稀酸中能与高铁离子发生显色反应、硫酸盐与氯化钡试液能生成白色硫酸钡沉淀,以及液相色谱法测定供试品溶液主峰的保留时间(tR)与对照品溶液主峰的保留时间(tR)等,建立了硫酸头孢喹肟注射液可用显色法、沉淀反应和液相色谱法进行鉴别。建立了硫酸头孢喹肟注射液中硫酸头孢喹肟含量测定的高效液相色谱法(HPLC)。色谱条件：色谱柱为Alltech alltima C18柱(250mm×4.6mm,5μm),柱温25℃,流动相为高氯酸钠-磷酸-乙腈(500：6：57,pH3.5±0.1),流速为1.0mL/min,紫外检测波长为269nm,进样量20μL。结果显示硫酸头孢喹肟在11.78～235.6μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9998),平均回收率为99.70%,RSD为0.435%。将三批硫酸头孢喹肟注射液,分别进行加速和长期稳定性试验,通过测定外观性状、分解产物和含量等各项指标,与0时进行比较。结果表明,硫酸头孢喹肟注射液在40±2℃条件下放置6个月时,外观色泽加深；液相检查,总杂质均已超过4%,在30+2℃条件下放置6个月时,外观色泽稍加深；液相检查,2,3-环已基吡啶峰、其他单个最大峰、总杂质峰均未超标,含量也在合格范围,在凉暗处贮存18个月后,有关物质逐渐增加,但仍未超过标准规定的限度。试验选用4只健康家兔,分两组进行刺激性试验。第一组2只家兔在四头肌处肌注头孢喹肟混悬注射液后48小时内,食欲与饮欲稍有下降,四肢外观无明显变化,剖检发现股四头肌为轻度出血,且有散在出血点,但无肌肉变性现象；第二组2只家兔注射后7天内,食欲与饮欲无明显下降,四肢外观无明显变化,7天后解剖检查表明,股四头肌基本不出血,无肌肉变性现象。试验表明供试品的局部试验对动物肌肉的刺激性较弱。3、在猪体内药代动力学生物等效性试验及残留消除试验试验对所研制的硫酸头孢喹肟注射液(2.5%)进行了猪体内药代动力学生物等效性试验,药代动力学过程表现为二室开放模型。与参照组比较,受试组吸收较慢,达峰时间较长,消除较缓慢。受试组AUC90%置信区间为104.1%-120.0%,在参照组均值的80%-120%范围内；Cmax90%置信区间为99.6%-116.7%,在参照组均值的70%-130%范围内。表明受试品和参照品个体间、周期间和剂型间符合生物等效性的统计学要求,为生物等效制剂。建立了猪组织中头孢喹肟的固相萃取-高效液相色谱(SPE-HPLC)测定方法,并对硫酸头孢喹肟注射液在猪体内的残留消除规律进行了研究。组织样品中头孢喹肟残留采用磷酸盐缓冲液和乙腈提取,C18固相萃取小柱净化,磷酸盐缓冲液淋洗、乙腈溶液洗脱。头孢喹肟含量采用高效液相色谱紫外检测器检测,外标法定量。测定方法的LOD(检测限)和LOQ(定量限)分别为5～30ng/g和20～100ng/g。在0.02～2.0μg/g添加范围内,平均回收率55.7%～79.4%,变异系数低于6.7%。建立的猪组织中头孢喹肟残留测定的技术参数能满足猪组织中头孢喹肟残留测定要求。健康猪按2mg/kg剂量肌肉注射2.5%头孢喹肟注射液,每日1次,连续5d,最后一次给药后0.5、1、2、3、5、7、9d分别宰杀5头猪,采集肌肉、脂肪、肝脏和肾脏,测定组织中头孢喹肟残留量。头孢喹肟主要残留于猪的肾脏和肝脏,脂肪和肌肉中残留较少,提示肾脏和肝脏为头孢喹肟在猪体内残留的靶组织。停药3d后,所有组织中药物残留量均低于EMEA规定最高残留限量(MRLs)。研究结果表明,硫酸头孢喹肟在猪组织中消除迅速。建议休药期为3d。4、治疗奶牛大肠杆菌性乳房炎试验及在泌乳奶牛的牛奶中残留消除试验试验选取了24头大肠杆菌性显性乳房炎病牛,一组肌肉注射头孢喹肟混悬注射剂作治疗试验组,另一组肌肉注射氨苄西林钠作药物对照组,结果表明,硫酸头孢喹肟混悬注射剂与注射用氨苄西林钠对奶牛大肠杆菌性乳房炎均有较好的治疗效果,在控制病程和产奶量方面头孢喹肟混悬注射剂明显优于注射用氨苄西林钠,肌肉注射硫酸头孢喹肟混悬注射剂1mg/kg.bw,其临床治愈率可达90%以上细菌学治愈率可达80%以上。建立了头孢喹肟在牛奶中残留的高效液相色谱检测方法。牛奶中头孢喹肟残留采用乙腈提取,提取液旋转蒸干,残留物用流动相复溶,进行高效液相色谱测定。流动相为醋酸-醋酸钠缓冲液：甲醇(83：17,v/v),紫外检测波长为270nm。检测结果表明,头孢喹肟在0.02～2μg/mL范围内呈良好的线性相关(R2≥0.9997)。在0.02μg/mL、1μg/mL、2μg/mL的添加水平上,头孢喹肟在牛奶中的平均回收率为85.28%～98.56%,日内和日间变异系数分别为1.55%～4.36%、0.40%～2.01%,最低检出限为0.01μg/mL,定量限为0.02μg/mL。试验选择4头处于泌乳期的健康荷斯坦奶牛,试验前未使用过头孢喹肟。硫酸头孢喹肟混悬剂按推荐剂量于奶牛颈部肌内注射,1次/d,连用2日。停药后按预定时间点(0.5、12、24、36、48、60、72、84、96、108h)采集奶样。利用建立的牛奶中头孢喹肟残留检测高效液相色谱测定牛奶中头孢喹肟残留。检测结果显示,泌乳奶牛肌内注射硫酸头孢喹肟注射液后24h,牛奶中头孢喹肟残留浓度达到最高值,此后迅速消除,至84h时牛奶中的药物残留低于最高残留限量(0.02μg/mL),建议该药在奶牛中的弃奶期为4d。