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背景:恶性胶质瘤是最常见的脑部原发性恶性肿瘤,即使患者接受手术治疗并且辅以术后放疗和化疗,平均生存期也不过一年多[4]。由于胶质瘤细胞对目前使用的化疗和放疗不敏感,不易发生凋亡,因此诱导肿瘤细胞程序性坏死或可成为一种新型而有效的治疗策略[6,7]。不同于细胞凋亡,程序性坏死作为一种caspase非依赖性的程序性细胞死亡方式,具有与坏死相似的细胞形态学改变,并且主要受到受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)和3(RIP3)调控。当诱导程序性坏死时,被激活的RIP1通过RIP同型作用基团与其下游信号因子RIP3相互作用形成一种称为“坏死体”(necrosome)的蛋白复合体,其中RIP3可能通过RIP1或自磷酸化作用而被激活[8]。细胞程序性坏死通常伴有细胞能量耗竭、细胞膜破裂以及细胞核DNA双链断裂,研究发现,RIP1和RIP3的激活能够导致细胞能量耗竭和细胞膜破裂[9,10],而其在细胞核DNA双链断裂中发挥的作用尚不明确[11]。DNA双链断裂通常发生在DNA复制时或者受到电离辐射、化疗药物、氧化应激作用之后[12]。通常,DNA双链断裂后如果得不到修复或者被错误修复,细胞将无法继续存活,因此DNA双链断裂对于细胞来讲是最严重的DNA损伤[13]。最近研究发现,细胞染色质裂解与DNA双链断裂密切相关[11]。当DNA双链断裂时,毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ATM)或DNA依懒性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)将被激活,进而在丝氨酸139位点将组氨酸突变亚型H2AX磷酸化产生γH2AX[14]。无论是体内还是体外,γH2AX都能特异性地聚集在DNA双链断裂的位点,因此被认为是DNA双链断裂的敏感性分子标志物[15,16]。在细胞程序性坏死过程中,尽管γH2AX能够作为DNA修复时各种蛋白分子发挥作用的平台,但是它同样能够促使AIF(凋亡诱导因子)从线粒体向核内转移而形成DNA降解复合体[11]。因此,DNA双链断裂是程序性坏死过程中导致染色质裂解的关键环节。紫草素是从紫草中提取出的天然的萘醌类化合物。近年来研究表明,紫草素可以诱导胶质瘤细胞发生程序性坏死[17],除此之外,在其他癌细胞诸如乳腺癌、多发性骨髓瘤及骨肉瘤同样可以产生类似的作用[18-20]。另外,紫草素可以造成DNA损伤且能抑制DNA合成[21,22]。然而,紫草素诱导DNA损伤是否受到RIP1和RIP3调控,尚不明确。因此,我们使用大鼠及人类胶质瘤细胞系以及移植瘤鼠模型来研究RIP1和RIP3在紫草素诱导胶质瘤细胞DNA双链断裂中的作用及机制。目的:用大鼠及人类胶质瘤细胞系以及移植瘤鼠模型来研究RIP1和RIP3在紫草素诱导胶质瘤细胞DNA双链断裂中的作用及机制。方法:1、通过MTT法检测细胞生存率2、通过流式细胞学检测方法(Annexin V-FITC和PI双染)研究胶质瘤细胞的死亡模式。3、通过单细胞琼脂糖凝胶电泳法(彗星实验)检测胶质瘤细胞的DNA损伤和DNA双链断裂。4、通过DCFH-DA探针检测胶质瘤细胞中的活性氧(ROS)生成水平的改变,并通过Mito SOX red探针检测胶质瘤细胞线粒体超氧化物生成水平的改变。5、通过DTNB-GSSH还原酶回收检测法检测胶质瘤细胞中GSH含量的改变。6、通过si RNA沉默RIP1和RIP3基因来研究RIP1和RIP3在紫草素诱导胶质瘤细胞程序性坏死中的作用。7、通过建立裸鼠C6细胞移植瘤模型研究紫草素在体内环境下对胶质瘤细胞的作用。8、通过免疫蛋白印迹法(western-blotting)检测分析胶质瘤细胞及裸鼠胶质瘤移植瘤组织中相关蛋白分子的表达水平变化。9、通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测胶质瘤细胞及其培养液中TNF-α水平改变。10、通过免疫组织化学染色法观察胶质瘤组织中巨噬细胞浸润的改变。11、通过免疫荧光染色法在激光共聚焦显微镜下观察胶质瘤细胞中γH2AX表达的改变。12、通过免疫共沉淀法检测胶质瘤细胞及裸鼠胶质瘤移植瘤组织中RIP1和RIP3的相互作用。结果:1、MTT法检测结果表明:在一定浓度范围内,紫草素作用3小时后能够降低胶质瘤细胞的生存率,而不影响正常细胞的生存率。流式细胞学检测结果表明:紫草素诱发胶质瘤细胞发生坏死而非凋亡。2、在紫草素作用下,胶质瘤细胞中RIP1和RIP3表达水平增加,并呈现时间梯度依赖性。免疫共沉淀RIP1或RIP3结果提示:紫草素能够促进RIP1与RIP3结合形成坏死体。MTT法检测结果表明:RIP1抑制剂(NEC-1)或RIP3抑制剂(GSK872)以及si RNA沉默RIP1或RIP3基因能够降低紫草素对胶质瘤细胞的杀伤作用。而NEC-1能够抑制紫草素所致的胶质瘤细胞中RIP1过度表达。GSK872能够抑制紫草素所致的胶质瘤细胞中RIP3过度表达。紫草素作用时间延长,CYPD表达逐渐增加而caspase8表达逐渐降低,而caspase3,被激活的caspase3以及被激活的caspase8表达水平无明显变化。紫草素能够抑制胶质瘤细胞释放TNF-α。3、单细胞琼脂糖凝胶电泳法(彗星实验)结果表明,紫草素能够导致胶质瘤细胞发生DNA损伤和DNA双链断裂,而这种效应可被NEC-1或GSK872抑制。免疫荧光染色结果表明,紫草素能促进胶质瘤细胞核中γH2AX的形成。紫草素诱导胶质瘤细胞γH2AX和p-ATM表达,并呈时间梯度依赖性,而NEC-1或GSK872,si RNA沉默RIP1或RIP3基因能抑制γH2AX和p-ATM过度表达。4、裸鼠C6细胞移植瘤模型结果表明,相对于对照组,紫草素处理组的移植瘤体积和重量明显减小,且移植瘤组织中RIP1、RIP3、γH2AX和p-ATM过度表达,RIP1和RIP3组合成坏死体亦增加。另外,紫草素处理组的移植瘤组织中HMGB1,HSP70及钙网蛋白水平升高,而免疫组织化学染色法观察到移植瘤组织中巨噬细胞浸润明显增加。5、DCFH-DA探针检测法可观察到紫草素能诱导胶质瘤细胞ROS过度生成,而NEC-1或GSK872能抑制ROS过度生成。Mito SOX red探针检测法观察到紫草素能诱导胶质瘤细胞线粒体超氧化物过度生成,而NEC-1或GSK872能抑制超氧化物过度生成。DTNB-GSSH还原酶回收检测法结果表明,紫草素使胶质瘤细胞GSH的生成减少,而NEC-1或GSK872预处理后,紫草素诱导的胶质瘤细胞GSH生成减少效应明显受到抑制。6、DCFH-DA探针荧光检测结果提示过氧化氢能诱导胶质瘤细胞ROS过度生成,NAC可阻断ROS过度生成。MTT法检测结果表明,过氧化氢使胶质瘤细胞生存率下降,而NAC能阻断过氧化氢诱导的细胞生存率下降。彗星实验结果表明,过氧化氢能使胶质瘤细胞DNA损伤和DNA双链断裂。过氧化氢能使胶质瘤细胞中γH2AX和p-ATM过度表达,而NAC可抑制γH2AX和p-ATM过度表达。另外,NAC可阻断紫草素诱导的胶质瘤细胞ROS过度生成,生存率下降,DNA损伤和DNA双链断裂,RIP1,RIP3,γH2AX和p-ATM过度表达。此外,NAC和NEC-1均可抑制RIP1和RIP3相互作用组合成坏死体。结论:1、紫草素对体内和体外的胶质瘤细胞均具有显著的杀伤作用。2、紫草素提高了胶质瘤细胞中RIP1、RIP3的表达、促进RIP1和RIP3之间的相互作用。因此,紫草素诱导了胶质瘤细胞的Necroptosis.3、紫草素在诱导胶质瘤细胞Necroptosis的过程中伴有DNA双链断裂;ROS是紫草素诱导胶质瘤细胞DNA双链断裂的效应分子。4、RIP1和RIP3通过促进线粒体内过氧化物的生成以及降低细胞内GSH的水平,从而诱导了胶质瘤细胞内ROS的过度生成。