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旋毛虫病是一种常见的世界性分布的人兽共患寄生虫病,严重危害人类健康和畜牧业生产。人主要因食入含旋毛形线虫(简称旋毛虫,Trichinella spiralis)囊包幼虫的肉类而感染旋毛虫病。旋毛虫是一种组织寄生虫,在长期与宿主免疫系统抗争的过程中,形成了复杂的免疫逃避机制。旋毛虫的免疫逃避是旋毛虫病综合防制中十分棘手的问题之一。旋毛虫的生活史中肌幼虫寄生于宿主的横纹肌细胞内,成虫主要寄生于宿主小肠,而新生幼虫则在侵入机体各组织器官之前,存在于血液及淋巴管内。因此,旋毛虫在组织之间移行的时侯,特别是新生幼虫阶段,不可避免的暴露于宿主抵御病原体的第一道防线补体系统的攻击之下,因此逃避补体系统的杀伤对于旋毛虫是否能在宿主体内成功建立感染,并长期生存下来具有非常重要的影响,但是其逃避补体攻击的具体的分子机制至今尚未阐明。
副肌球蛋白(paramyosin,Pmy)是存在于无脊椎动物肌肉组织中,组成粗肌丝的一种结构蛋白,在脊椎动物体内无此蛋白。越来越多的实验证据证明副肌球蛋白不仅是一种结构蛋白,而且也可分布于某些寄生蠕虫的体表,是非常重要的免疫调节分子。在本课题组的前期工作中,我们成功克隆了编码全长旋毛虫副肌球蛋白(Ts-Pmy)基因,并用重组旋毛虫副肌球蛋白(recombinant Ts-Pmy,rTs-Pmy)免疫BALB/c小鼠使其对旋毛虫的感染产生了部分的免疫保护作用。然而该重组蛋白通过什么机制诱发机体免疫应答?Ts-Pmy是否也具有免疫调节功能?本实验旨在探讨虫体Ts-Pmy是否可以通过与宿主补体组分相互作用,来帮助虫体逃避宿主补体的免疫攻击。
本实验分为以下几个部分:首先,为开展Ts-Pmy的免疫定位研究需要制备大量的抗TS-Pmy单克隆抗体。故将5×106~7个处于对数生长期的能分泌抗旋毛虫副肌球蛋白单抗的7E2杂交瘤细胞,经腹腔注射至雌性BALB/c小鼠体内,两至三周左右处死小鼠并收集腹水。SDS-PAGE电泳检测结果显示,用蛋白A亲和层析法纯化后的抗体具有较高的纯度。
其次,为探讨Ts-Pmy基因在旋毛虫不同发育阶段的表达情况,分别提取肌幼虫、成虫和新生幼虫的总RNA,应用特异性引物行RT-PCR,得到的扩增产物的分子大小为900bp,与预测值相符,表明肌幼虫、成虫和新生幼虫三个发育阶段均有Ts-Pmy基因的转录。将旋毛虫虫体抗原与抗Ts-Pmy McAb7E2进行Western blot,在102kDa处产生杂交信号,提示旋毛虫肌幼虫、成虫及新生幼虫虫体均表达Ts-Pmy蛋白。实验结果表明旋毛虫肌幼虫、成虫和新生幼虫三个不同发育阶段均有Ts-Pmy基因的转录和翻译。
为进一步确定Ts-Pmy在虫体的分布情况,在Van Gieson染色了解旋毛虫组织结构的基础上,应用免疫组织化学的方法证实Ts-Pmy蛋白主要存在于体壁,皮下肌层及消化管道和其他肌肉结构组织中。并利用免疫电镜检测方法进一步确认成虫和新生幼虫的体表最外层有Ts-Pmy分布。完整的活虫虫体免疫荧光显色也证实了成虫和新生幼虫的体表外层有Ts-Pmy分布。
再次,为了观察分布在旋毛虫体表的副肌球蛋白是否对虫体逃避补体体外杀伤方面有影响,用加热灭活补体的抗Ts-Pmy兔血清封闭新生幼虫虫体体表的Ts-Pmy,再用正常豚鼠血清作为补体供体杀伤虫体。结果显示,虫体体表Ts-Pmy被封闭后,新生幼虫在补体的作用下,存活率下降,与加入正常兔血清对照组比较具有统计学差异(P＜0.05),且补体介导的杀伤虫体效应与抗Ts-Pmy抗体的量呈剂量依赖关系。当免疫血清被rTs-Pmy蛋白吸附去除抗Ts-Pmy抗体之后,补体对虫体无明显的杀伤效应。而加入另外一种抗旋毛虫Ts87蛋白的特异性抗体作为对照未增加补体介导的杀虫效应。
随后,为了进一步观察在新生幼虫体表的Ts-Pmy被特异抗体封闭的情况下,受到豚鼠补体攻击后的虫体活力是否受到影响,特将受到补体攻击后的新生幼虫经尾静脉被动转移到BALB/c小鼠体内,26天后计算肌幼虫的数量。结果显示经含抗rTs-Pmy抗体的免疫兔血清及正常豚鼠血清处理过的新生幼虫发育成肌幼虫的数量比对照组减少了95.1%(P＜0.01)。免疫兔血清被重组蛋白吸附处理组与对照组无统计学差异。实验进一步证明体表分布的Ts-Pmy可以帮助新生幼虫逃避补体介导的杀伤。
最后,功能分析显示rTs-Pmy可以与补体C8、C9结合,并影响C9的聚合,从而抑制补体膜攻击复合物(MAC)的形成。另外,替代途径激活豚鼠补体后,rTs-Pmy可以抑制补体介导的溶解兔红细胞的作用。实验结果提示TsPmy是通过对补体末端通路的抑制而发挥补体免疫逃避的作用。
总之,旋毛虫体表最外层分布的Ts-Pmy,可以通过抑制宿主补体膜攻击复合物的形成,继而保护虫体免受补体的攻击,在虫体免疫逃避中发挥重要作用,这是旋毛虫的一种有效的生存策略。干扰Ts-Pmy的免疫调节功能可为寻找防控旋毛虫病提供新的思路。