论文部分内容阅读
目的：癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，以脑神经元异常放电引起的痫性发作为特征。癫痫的发生和脑内兴奋性、抑制性神经递质失衡有关。γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)均属于氨基酸类递质，分别为神经系统的抑制性和兴奋性神经递质。GABA及其受体在癫痫中的作用已广泛研究，目前越来越侧重于GABA受体与癫痫之间的相互关系的研究。与癫痫关系密切的GABA受体主要是GABAA受体(GABA-AR)和GABAB受体(GABA-BR)。谷氨酸(Glu)在体内存在相应的受体，按能独立激活受体物质的不同将Glu-R分为：N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate，NMDAR)、红藻酸(Kainate，KA)受体、使君子氨酸(Quisqualate，QA)受体、氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体及L-2-氨基-4磷酰丁酸(L-AP4)受体，后四种合称为非NMDAR受体。神经肽Y(NPY)是由36个氨基酸组成的一种肽类物质，其广泛分布于中枢神经系统及周围神经系统，在中枢神经系统中以海马内浓度最高。NPY作为一种神经递质，其与去甲肾上腺素、肾上腺素、γ-氨基丁酸(GABA)、生长抑素等经典的神经递质共存。大量研究证实NPY与癫痫之间的确存在着密切的关系，NPY在抗癫痫的过程中发挥着重要的作用。本实验通过观察探讨重组腺相关病毒载体神经肽Y(rAAV2/1-NPY-EGF-P)干预前后海人酸致痫大鼠海马中GABA-BR，NMDAR的亚基NR1和NR2A及NPY表达的变化情况来探讨癫痫的发病机理。 方法：将36只雄性Wistar大鼠建立随机分为两组：对照组(NS组)和实验组。实验组建立慢性癫痫模型：造模成功后分两组：海人酸致痫大鼠组(KA组)以及神经肽Y(NPY)干预组(NPY组)。KA组大鼠海马CA3区注射KA，造模成功后不注射病毒；NPY组大鼠在慢性模型成功后，向脑室注射10μl的rAAV2/1-NPY-EGFP进行基因转染手术，滴度为5×1011 v.g./ml。对照组海马CA3区注射等量的生理盐水。各组动物分别于基因转染后2w、4w，观察其发作行为学变化，深部麻醉后快速断头，冰上取海马，置于Eppendorf管中，液氮中保存备。每组动物选取12只，每个时间点6只大鼠，用RT-PCR检测GABA-BR的表达，扩增完毕后，以GAPDH为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(RQ值)，我们将RQ值用于统计分析，定量分析其表达情况。RT-PCR的结果采用ANOVA单因素方差分析，GABA-BR各组之间的相关性用Spearman等级相关分析，按照P<0.05作为检验水准。用免疫组化方法检测各组NR1，NR2A，GABA-BR和NPY的表达情况。用双盲法统计试验结果，采用半定量积分法，对每个点的阳性细胞率及阳性细胞着色强度分别进行分级记分，然后根据两项之和确定其阳性强度。 结果：⑴NPY组大鼠在干预后发作明显减少，KA组发作无明显变化。⑵通过RT-PCR发现，对照组(NS组)、KA组及NPY组海马组织均有GABA-BR表达。KA组GABA-BR的基因表达较对照组下降(p<0.05)，而NPY组GABA-BR的基因表达有上升趋势，且有统计学意义。GABA-BR于两个时间点的变化不大。⑶通过免疫组化技术，也证实了对照组(NS组)与KA组、NPY组中NR1、NR2A、GABA-BR及NPY表达情况存在明显差异。发现KA组NR1、NR2A、NPY表达明显增高，GABA-BR表达降低；NPY组其NR1、NR2A表达明显下降，NPY表达持续升高，GABA-BR表达有上升趋势。 结论：①KA组中GABA-BR的表达明显下降，NPY组其表达有回升趋势。这说明GABA-BR基因表达的降低可能是导致癫痫发生、发展的重要因素。NPY可能通过改变抑制性神经递质的GABA-BR的表达来达到调控癫痫发作的目的。②NMDA受体低表达可能参与了NPY抑制癫痫发作的发病机制。