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冠状病毒是目前已知的最大的RNA病毒,其基因组全长为27～31Kb。冠状病毒庞大的基因组以及携带其复制酶序列的质粒在细菌中的不稳定性长期阻碍了冠状病毒反向遗传学的发展,直到2000年Almazan等首次利用DI-RNA和BAC质粒系统成功构建了TGEV的全长cDNA感染性克隆。经过几年的发展,已经成功开发出了三种冠状病毒的拯救系统,包括基于BAC的拯救系统、体外连接覆盖基因组全长的cDNA策略以及基于痘苗病毒载体的拯救系统。HCoV-OC43属于Ⅱ组冠状病毒,其基因组全长约为30.7Kb,为不分节段的单股正链RNA,具有典型的5’帽子结构和3’poly A尾结构。基因组结构为5’-polymerase-HE-S-E-M-N,另外还有两个非结构基因NS2和NS12.9分别位于HE之前以及S和E基因之间,其功能目前还不清楚。由于HCoV-OC43和SARS病毒一样同属于Ⅱ组冠状病毒,因此可以将其作为SARS的模式病毒来研究,以克服SARS研究对P3实验室的依赖性。2006年,加拿大学者成功构建基于BAC系统的HCoV-OC43全长cDNA感染性克隆为我们进一步研究HCoV-OC43提供了很好的基础和平台。通过基因缺失、插入、替换等方法,我们可以研究病毒的蛋白和基因组功能、致病机理等等。本研究在该感染性克隆的基础上对利用HCoV-OC43表达外源基因的可行性进行了探索,主要研究结果如下：第一,在质粒pBAC-OC43FL的基础上,按照文献报道的方法成功获得了拯救病毒,并通过转染后上清感染实验、免疫荧光、Western blot对拯救病毒进行了鉴定。第二,利用两步法融合PCR和酶切连接的方法,成功构建了三个不同位置携带外源报告基因GFP的重组pBAC-OC43FL质粒。在HCoV-OC43全长cDNA感染性克隆pBAC-OC43FL的基础上进行改造,成功构建了带GFP外源报告基因的三个重组质粒,分别命名为pBAC-OC43-GFP Δ NS2、pBAC-OC43-GFP A NS12.9和pBAC-OC43-N-GFP,分别表示GFP取代NS2基因、GFP取代NS12.9基因以及GFP插入N基因后。第三,初步确定了三个不同的插入位置中,只有取代NS2、NS12.9时能获得拯救病毒。获得重组质粒后,按照先前报道的拯救程序进行病毒拯救,实时观察GFP的表达情况。根据GFP表达水平、免疫荧光以及Western blot,我们发现只有取代NS2和取代NS12.9的克隆获得了拯救病毒,而GFP插入N基因后的克隆没有获得拯救病毒。此外,当GFP取代NS2基因后,能获得GFP基因的高效稳定表达；而当GFP基因取代NS12.9时,GFP表达量较少,且不稳定。目前HCoV-OC43非结构基因NS2和NS12.9的基因功能还不是很清楚。研究中我们发现,按照文献报道的OC43-FL的拯救方法对OC43-GFP△NS2进行拯救,取上清感染无法检测到GFP和N蛋白的表达,而OC43-FL及OC43-GFP△NS12.9在收取上清后能感染新的细胞。同时,收获OC43-GFP△NS2转染后的细胞冻融裂解上清,感染新的细胞,能检测到GFP以及N蛋白的表达。基于此,初步分析其可能的原因是NS2的缺失影响了病毒的释放,仍需进一步研究。总之,本研究在HCoV-OC43全长cDNA感染性克隆的基础上,通过在三个不同的位置插入外源报告基因GFP,观察外源基因表达情况和对拯救病毒进行体外鉴定,确定了pBAC-OC43FL可能的插入位置,以及插入位置处的蛋白在复制过程中的潜在作用,为进一步研究HCoV-OC43.构建基于HCoV-OC43的冠状病毒载体提供了参考依据。