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背景与目的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是干细胞家族的重要成员。BMSC具有多向分化潜能，特定的诱导条件下BMSC在体内或体外，可分化为骨、软骨、脂肪、韧带、肌腱、肌肉、肝、心肌、内皮、甚至神经等多种组织细胞。BMSC定向分化的研究已经成为研究热点，日益受到人们的关注。微小RNA(microRNA, miRNA)是具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20-25个核苷酸，广泛存在于真核生物中并能通过与靶标基因的mRNA上的3′端非编码区特异结合配对来调节靶标基因的翻译或者保持其稳定性。有研究证实microRNA分子在转录水平和转录后水平参与控制骨髓基质干细胞多种基因的时空表达差异；发现miR-128高水平表达于中枢神经系统。有研究表明Wnt信号传导途径参与激活骨髓基质干细胞向神经细胞的定向分化。我们利用生物信息学软件分析，推测Wnt3a是microRNA-128的靶基因，microRNA-128可能通过调控Wnt3a影响骨髓基质干细胞向神经细胞的定向分化。因此，本实验通过两个部分来探讨MicroRNA-128对大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用和MicroRNA-128调控大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的机制。第一部分MicroRNA-128对大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用方法：1．取4周龄150g左右的SD大鼠收集骨髓分离培养，收集第3代细胞，流式细胞术检测细胞表面标志CD29，CD34、CD44、CD45、CD105。2．BMSC细胞达到90%汇合时，将细胞消化使用BTX2001电转。类似物组：转染miR-128mimics，加入bFGF和EGF诱导；抑制剂组：转染miR-128inhibitor，加入bFGF和EGF诱导；诱导组：不转染，但加入bFGF和EGF诱导；空白组：不转染不诱导。3．qRT-PCR方法检测各组细胞miR-128表达水平。4．TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测法，分别检测β3-tubulin，MAP-2，NF-M，NSE，GFAP，Nestin，Vimentin，Wnt3a mRNA表达水平。5．Western-blot分别检测β3-tubulin，MAP-2，NF-M，NSE，GFAP，Nestin，Vimentin，Wnt3a蛋白表达水平。6．免疫荧光方法分别检测GFAP，Nestin蛋白表达和细胞形态学变化。7．细胞免疫化学方法检测Nestin蛋白表达和细胞形态学变化。8．采用SPSS V17.0软件，数据以mean±SD表示，两组间使用t检验，多组间采用单因素方差分析，以α<0.05为差异显著。结果1.第3代细胞已表达BMSCs细胞表型阳性特征，其CD29、CD44、CD105，阳性率分别为99.26%，99.14%，98.45%；CD34、CD45呈阴性，阳性率分别为1.58%，1.82%。2.空白组细胞miR-128的表达水平与诱导对照组差异无显著性（P>0.05）；而抑制剂组细胞miR-128的表达水平显著低于2个对照组（空白组，诱导对照组）（P<0.01）；类似物组细胞miR-128的表达水平显著高于2个对照组（P<0.01）。3.7个神经元样细胞标志(β3-tubulin, MAP-2, NF-M, NSE, GFAP, Nestin,Vimentin)和Wnt3a mRNA的表达量，在有bFGF和EGF诱导的诱导组、类似物组和抑制剂组均高于空白对照组细胞，差异有显著性（P<0.05）；其中抑制剂组细胞的表达量高于诱导组细胞，差异有显著性（P<0.05），类似物组细胞的相对表达量低于诱导组细胞，差异有显著性（P<0.05）。4.7种神经元样细胞标志蛋白β3-tubulin, MAP-2, NF-M, NSE, GFAP, Nestin,Vimentin在四组细胞中均未见免疫印迹出现。在加人bFGF和EGF诱导的3组，其中类似物组细胞的蛋白印迹均显著弱于诱导组细胞，同时抑制剂组细胞的印迹均显著强于诱导组细胞。说明转染miR-128Inhibitor下调miR-128可促进bFGF和EGF诱导神经元样细胞标志的高水平表达，而转染miR-128mimic上调miR-128可抑制bFGF和EGF诱导神经元样细胞标志的表达5.神经元样细胞标志蛋白GFAP和Nestin免疫荧光强度依次为，抑制剂组>诱导组>类似物组；具有的神经元细胞学特征抑制剂组>诱导组>类似物组；空白组无荧光显现。6. Nestin免疫化学染色强度和具有的神经元细胞学特征依次为，抑制剂组>诱导组>类似物组>空白组；抑制剂组细胞形态上非常接近神经元细胞。第二部分MicroRNA-128调控大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的机制方法1.使用网上在线分析软件miRanda，miRDB，RNA22，TargetScan和miRWalk分析预测miRNA-128与Wnt3a基因结合调控区（seed region）。2.采用overlap PCR方法，以大鼠基因组DNA为模本扩增出野生型/突变型Wnt3a基因3’UTR区，构建野生型/突变型报告基因载体。分别与miR-128/Scramble共转染BMSC，测定荧光素酶活性。3.构建缺3’UTR的Wnt3a真核表达载体pcDNA3.1-Wnt3a,进行rescue实验。4.合成Wnt3a siRNA，与miR-128共转染BMSC进行进行rescue实验。结果1．Target预测显示Wnt3a基因3’UTR区存在与miRNA-128结合的8mer seedregion。2．测序分析证实构建出Wnt3a基因3’UTR区野生型/突变型报告基因载体；野生型报告基因载体与miR-128细胞Luc荧光素酶活性显著减低，（P<0.05）。3．缺3’UTR的Wnt3a表达载体/miR-128共转染细胞，呈现出miR-128负调控Wnt3a表达失效。4．Wnt3a siRNA沉默细胞向神经样细胞分化效应，与转染miR-128Mimic完全一致，结论1．下调BMSC中miR-128水平可促进bFGF和EGF诱导向神经元样分化，而上调则对其有抑制作用。2．Wnt3a是miR-128的靶基因； miR-128是通过与Wnt3a3’UTR seed region结合，负调Wnt3a基因表达；miR-128对BMSCs向神经样细胞分化的作用是通过调控Wnt3a实现。