CP1菌抗菌蛋白的抗菌谱测定及抗真菌机理研究

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CPI菌株是新分离的一种能胞外分泌抗菌蛋白的多粘类芽孢杆菌。经初步研究发现,该菌分泌的抗菌蛋白对一些细菌和真菌有较好的抑杀作用。为了更确切地了解该菌的抗菌谱及其作用效应,为该菌的开发利用提供理论依据,本文在前人的研究基础上,对CPl菌产生的抗菌蛋白进行较系统的抗菌谱的测定,并以一种类酵母真菌(出芽短梗霉)作为研究对象,从动力学、细胞及分子水平上研究其作用机理。 选择抗菌药物常用的指示菌,采用琼脂平板稀释法测定CPl菌抗菌蛋白的抗菌谱。分别以1种菌代表1个属的受试的12种细菌和真菌中,CPl菌抗菌蛋白对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌和宛氏拟青霉菌的抑菌效果最佳,占测试菌总数的41.7%,粗提蛋白的抑制浓度均在10%以下;对金黄色葡萄球菌、出芽短梗霉、白假丝酵母、绿色木霉和黑曲霉的抑菌效果次之,占41.7%,抑制浓度在15~30%之间;对枯草芽孢杆菌黑色变种和蜡叶芽枝霉抑制效果最低。进一步测定CPl菌粗提蛋白对4株革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度MIC:大肠杆菌为0.4%,肺炎克雷伯氏菌为1%,鼠伤寒沙门氏菌为6%,铜绿假单胞菌为8%。结果表明CPl菌抗菌蛋白抗菌谱广,且抗菌效果好。 从真菌生长的动力学角度探讨了CPI菌抗菌蛋白对出芽短梗霉的作用机理。结果表明,CPI菌抗菌蛋白对出芽短梗霉菌丝的生长有强烈的抑制作用,10%的浓度抑制率可达到66.4%,而且还对出芽短梗霉孢子形成和萌发均有抑制作用,对孢子还具有杀死作用,40%的浓度处理12h就可以完全杀死所有孢子。 从细胞水平上探索CPl菌抗菌蛋白抑菌作用的机理。经CPl菌抗菌蛋白处理的出芽短梗霉菌丝受到强烈破坏,生长缓慢,在光学显微镜下可观察到菌丝肿胀,原生质体凝集,有空泡,在一些部位菌丝发生破裂、细胞内容物向外泄漏;扫描电镜观察到菌丝整体畸形,菌丝体萎蔫,表面粗糙、凹陷,细胞外壁皱缩干瘪、变形,有些部位还可以观察到孔洞;透射电镜下观察到菌丝细胞壁和细胞膜模糊,界限不明显,细胞内成份固缩成团块状并形成大量细胞器消溶后的空白区。光学显微镜下观察CPl菌抗菌蛋白处理的孢子,可发现孢子变形,内容物有泄漏;扫描电镜下观察可见孢子表面粗糙、有异物,推测是孢子内容物泄漏所致,有些孢子还可以看到表面凹陷,甚至有孔洞;透射电镜下观察到孢子细胞壁、细胞膜变形、不完整,细胞质不均匀,细胞内容物固缩,细胞器变性消失。 通过对CP1菌抗菌蛋白作用下出芽短梗霉胞内蛋白质及离子的泄漏进行研究表明,CP1菌抗菌蛋白引起菌丝和孢子蛋白质的泄漏较明显,这与电镜下观察到的菌丝和孢子外壁皱缩、凹陷、孔洞、细胞壁和细胞膜不完整、胞内形成空白区等形态学变化的结果是相吻合的,说明CP1菌抗菌蛋白可直接引起菌丝体和孢子的外壁穿孔、破裂,胞内物质泄漏;CP1菌抗菌蛋白还能引起菌丝和孢子内Ca2+的泄漏,说明该抗菌蛋白能作用于出芽短梗霉菌丝体和孢子外膜,形成离子通道,显著地使Ca2+从菌体细胞中释放出来。 CP1菌抗菌蛋白对出芽短梗霉菌丝体和孢子的氧呼吸有明显的抑制作用,随着CPI菌抗菌蛋白浓度的增加,其耗氧百分率减少,呼吸作用从起始到停止经历的时间缩短。表明CPl菌抗菌蛋白对出芽短梗霉菌丝体和孢子氧呼吸的抑制作用是其活性作用的一个重要原因。 研究结果表明,CPl菌抗菌蛋白对出芽短梗霉菌丝体及孢子有显著的抑制作用,这种抑制主要在于CPI菌抗菌蛋白破坏细胞壁和细胞膜结构,引起胞内蛋白质、核酸和各种离子等重要成分的泄漏,及对呼吸作用的抑制,而最终导致菌体裂解、死亡。
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