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背景:高毒力肺炎克雷伯菌(HypervirulentKlebsiella pneumoniae,HvKP)常导致健康人群的严重社区获得性感染,而且感染易于发生多部位的播散。HvKP菌株具有较厚的荚膜,携带rmpA和aerobactin等毒力基因,毒力明显高于普通肺炎克雷伯菌(classic Klebsiellapneumoniae,cKP)。中性粒细胞可以通过胞内吞噬和胞外释放中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)2种途径抵抗病原微生物的感染。为了揭示HvKP高毒力和高致病性的机制,选取了 6株HvKP进行第三代测序和分析,并进一步研究人体中性粒细胞在抗HvKP感染中的作用。方法:选取不同荚膜血清分型的6株HvKP菌株(K1、K2、K57型HvKP各2株),利用PacBio第三代单分子实时测序技术(SMRT)进行测序,主要从毒力基因、耐药基因两方面展开分析,探索HvKP高致病性及高毒力的遗传基础。根据黏液丝试验、荚膜血清分型、rmpA和aerobactin基因检测结果,本研究共筛选了 45株肺炎克雷伯菌,包括16株HvKP-K1、14株HvKP-K2和15株cKP。采集健康志愿者新鲜血液并提取中性粒细胞。将中性粒细胞与FITC标记的HvKP-K1、HvKP-K2和cKP分别作用0、10、30、60min,流式细胞术检测中性粒细胞吞噬率,并在30和60 min时,采用透射电镜观察被中性粒细胞吞噬的细菌形态学改变。中性粒细胞与细菌作用60 min,通过计算细菌存活指数评估中性粒细胞的胞内杀菌能力。PMA、HvKP-K1和cKP分别刺激中性粒细胞,采用扫描电镜和免疫荧光染色技术观察NETs的形成情况以及NETs对HvKP-K1和cKP的捕获情况。结果:本研究测序的6株HvKP菌株含有的毒力基因明显多于cKP菌株,其中编码气杆菌素的iucABCD基因和编码沙门菌素的iroBCDN基因为HvKP菌株的特异基因。K1型HvKP菌株携带的毒力基因数量明显高于K2型和K57型HvKP菌株携带的毒力基因数量,K1型特异基因有21个,包括3个编码Kfu蛋白的kfuABC基因和18个氮摄取基因。编号为11420和11492菌株分别含有碳青霉烯类耐药基因blaKPC-2和β内酰胺类耐药基因blaCTX-M-24。中性粒细胞吞噬实验结果显示:在0-60 min内,中性粒细胞对HvKP和cKP的吞噬率随作用时间的延长而逐渐升高,10 min时中性粒细胞对HvKP-K1、HvKP-K2和 cKP 的吞噬率分别为(28.36 ±4.17)%、(30.46 ±3.52)%和(45.89 ±4.79)%;30 min时中性粒细胞对HvKP-K1、HvKP-K2和cKP的吞噬率分别为(39.13 ± 2.71)%、(41.96±3.16)%和(57.39±3.21)%;60min 时中性粒细胞对HvKP-K1、HvKP-K2和 cKP 的吞噬率分别为(45.77 ±3.21)%、(47.24 ±3.02)%和(60.29 ±3.13)%。透射电镜观察可见中性粒细胞吞噬的cKP多于HvKP,被吞噬的cKP菌体表面不完整,开始裂解,而被吞噬的HvKP-K1菌体完整,甚至可见菌体分裂相。中性粒细胞杀菌试验结果显示HvKP-K1和HvKP-K2的存活指数(分别为1.0450 ± 0.1455和0.9820 ±0.1013)明显高于cKP的存活指数(0.8038 ±0.0876)。尽管在扫描电镜下观察到HvKP-K1和cKP都可以诱导中性粒细胞形成NETs,并经进一步免疫荧光染色分析证实,但NETs捕获的cKP数量明显高于捕获的HvKP-K1的数量。此外,被NETs捕获的cKP菌体表面可见“小孔”,而被NETs捕获的HvKP-K1菌体表面未见此现象。结论:引起HvKP毒力显著增强的原因在于其携带的毒力基因明显多于cKP。中性粒细胞对cKP具有胞内和胞外杀伤作用,但HvKP能抵抗中性粒细胞的吞噬和胞内杀菌作用。cKP和HvKP都可以诱导中性粒细胞形成NETs,但NETs捕获的cKP数量明显高于HvKP。