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细胞衰老定义为不可逆的细胞周期阻滞,在肿瘤发生,机体衰老和胚胎发育等多种生物过程中起重要作用。细胞衰老是一个复杂的过程,参与调控的因素多种多样且彼此间相互影响,构成庞大精细的调控网络。近年来,不少研究证实衰老细胞发生了显著的代谢改变,反之细胞代谢的中间产物在细胞衰老过程中也发挥重要作用。本文研究糖酵解最后一步:磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)转变为丙酮酸(pyruvate)的限速酶-丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)。在人成纤维细胞细胞(human fiberblast,HFF)中有两种丙酮酸激酶亚型—PKM1和PKM2,由PKM基因进行不同剪切而成,其中以PKM2为主。丙酮酸激酶(M1和M2)缺失会引起人成纤维细胞发生细胞衰老,造成细胞增殖受阻,SA-β-Gal染色阳性细胞比例升高,G2/M期细胞周期阻滞,细胞呼吸作用增强和衰老相关分泌表型(SASP)因子表达增多等特征。敲降PKM激活DNA损伤反应(DDR)和p53-p21通路。细胞总活性氧(total ROS)的水平没有变化,但是线粒体活性氧(Mito ROS)在敲降PKM的HFF中有明显上调。PKM沉默后线粒体功能亢进,线粒体活性氧增多使DNA出现严重损伤,继而激活p53-p21通路出现不可逆的细胞周期阻滞,也就是细胞衰老。与人成纤维细胞这种终末分化细胞不同,干细胞具有多能性,PKM在干细胞中可能存在其他的功能。在人胚胎干细胞(hESC)中敲降丙酮酸激酶,细胞没有出现明显的表型变化,但是出现S期细胞周期阻滞和克隆形成能力减弱。进一步研究发现与HFF相同,hESC也激活了 DDR。另外多能性相关基因Nanog转录水平上调,蛋白水平下调,这暗示丙酮酸激酶影响人胚胎干细胞多能性。为了探讨丙酮酸激酶在个体水平对衰老的影响,我们选择秀丽隐杆线虫作为模式动物。线虫里编码丙酮酸激酶的基因有两个PYK1和PYK2,分别位于Ⅰ染色体和Ⅳ染色体,氨基酸编码序列相似度约50%。使用CRISPR/Cas9技术构建两PYK1::GFP与PYK2::GFP来确认PYK1和PYK2的表达情况。GFP knockIn实验显示PYK1胚胎时期就开始表达,幼虫期体壁也有表达,成虫期除体壁外生殖系统开始表达。这说明PYK1对胚胎发育,幼虫发育有重要作用,PYK2在幼虫期和成虫期主要在肠道表达。成虫中PYK1的表达量要高于PYK2,所以选择PYK1进行后续实验。PYK1 KnockOut strain出现胚胎致死,幼虫发育不良。尽管PYK1 KnockOut strain成虫存在体积较小的表型,但是不排除是卵或幼虫时期的缺陷导致的,所以不能归因于衰老加速。PYK1对线虫衰老的作用需要另选更适合的研究方法。