论文部分内容阅读
目的：明确蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage, SAH）小鼠皮层脑组织长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNAs）及信使RNA（mRNAs）的差异表达情况及其功能，旨在探讨lncRNAs调控SAH后早期脑损伤（Early brain injury, EBI）的作用机制及治疗靶点。 方法： 1.使用单动脉夹法改进小鼠血管内穿刺法构建 SAH模型，运用多模态对改进后的小鼠SAH模型进行评估。将雄性野生型C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（Sham）、经典 SAH模型（Classic）组及改进 SAH模型组（Improved）（各组用于各项数据检测各5只），分别采用常规穿刺模型及改进后的单动脉夹颈动脉内穿刺法构建SAH模型，常规检测颅内压及各项生命指标。运用运用神经功能学评分、疲劳转棒实验等检测神经功能，磁共振T2加权成像等技术分析脑水肿情况；18F-FDG PET/CT等技术评估手术切口损伤情况；原位末端转移酶标记、免疫荧光染色等技术检测神经元凋亡及小胶质细胞活化。 2.检测SAH小鼠皮层脑组织lncRNAs及mRNAs的差异表达情况。使用改进后的血管内穿刺法构建SAH模型，提取皮层总RNA。对质量检测合格的RNA提取物进行PCR扩增，并构建cRNA文库，使用Illurnina HiSeqTM2500工作平台进行高通量测序。通过软件Tophat2将测序得到的转录本与小鼠全基因组进行比对，并计算lncRNAs及mRNAs的相对表达量。使用KEGG、GO富集对差异表达的mRNAs进行生物学过程及Pathway分析；对差异表达的lncRNAs与mRNAs行Pearson相关系数检测，得到共表达网络。随机选取的5条lncRNAs，通过实时定量荧光PCR（qRT-PCR）法验证测序结果。 3. LncRNA fantom3-F730004F19的功能探究。在几种神经细胞细胞株中BV-2（小胶质细胞）、HT-22（神经元）、MA（星形胶质细胞）及MOPC（少突胶质细胞）作lncRNA fantom3-F730004F19的细胞分布分析。通过荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）染色对 lncRNA fantom3-F730004F19进行亚细胞定位分析。运用慢病毒沉默技术，结合免疫细胞技术、western blot及酶联免疫吸附试验等技术对 lncRNA fantom3-F730004F19进行功能验证。 结果： 1.成功改进小鼠进颈动脉内穿刺法构建 SAH模型，改进后的模型能更精准的模拟动脉瘤破裂导致的SAH，并造成更小的手术损伤、更短的操作时间以及操作过程中无颅内缺血。 2.获取Sham及SAH小鼠皮层脑组织lncRNAs及mRNAs的差异表达情况。SAH后，小鼠脑组织中lncRNAs共103种表达上调、514种下调；mRNAs共387种表达上调、54种mRNAs下调。KEGG Pathway及GO富集结果提示，差异表达的 mRNAs涉及生物学途径众多，如炎症反应、趋化因子激活等。随机选取的lncRNAs的变化趋势（antom3_C730003K16、fantom3_C730003K16、fantom3_1830129C17上调，fantom3_A430024L20、fantom3_C330006P03下调）经 qRT-PCR技术得到验证。共表达分析提示lncRNA fantom3_F730004F19与Toll样受体4（TLR4）通路密切相关。 3. FISH染色及qRT-PCR结果提示lncRNA fantom3_F730004F19主要定位于小胶质细胞核内。慢病毒沉默lncRNA fantom3_F730004F19后，能有效通过抑制小胶质细胞中TLR4及CD14的上调，抑制炎症反应。 结论： 小鼠SAH后皮层脑组织中lncRNAs及mRNAs表达与正常脑组织存在明显差异。与lncRNAs存在共表达关系的mRNAs涉及生物学途径众多。沉默lncRNA fantom3_F730004F19后，能有效通过抑制小胶质介导的炎症反应。LncRNAs在早期脑损伤中具体作用及机制的探索将为今后关于的SAH研究及SAH患者病情与预后的判断提供新的思路。