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本文围绕污染土壤生态安全的早期预警开展工作，以新型有机物四溴双酚A(TBBPA)和典型重金属Cd为研究对象，综合采用电子顺磁共振/EPR技术、流式细胞术、实时荧光定量PCR技术、扫描、透射电镜技术等多种现代分析技术和分子生态毒理学方法，从土壤动物蚯蚓对TBBPA和Cd单一及复合污染胁迫的早期应激响应出发，探讨蚯蚓体内活性氧自由基的积累和代谢水平和由此导致的脂质过氧化、溶酶体膜的损伤、蛋白质的氧化、纤维素酶的变化、细胞凋亡、基因表达等相关生理指标的影响以及抗氧化防御系统之间的耦合关系，在个体、细胞和分子水平多个水平上深入研究污染物胁迫下的氧化应激机制，揭示污染物的生物毒性和致毒机制，筛选敏感的蚯蚓生物标志物用作土壤污染生态系统的早期预警，并初步提出污染物土壤对蚯蚓的最小外源浓度，为污染土壤的早期诊断和土壤修复标准的制定提供新的实验依据。蚯蚓分子生物标志物由于其能对污染物低剂量长期暴露的早期损伤做出预警近年来成为国内外研究热点之一，并已在土壤环境生态风险评价中取得一些进展。本文主要研究了TBBPA和Cd单一及复合污染对蚯蚓的生物毒性和致毒机理，主要研究结果归纳如下：
1、TBBPA污染对蚯蚓的生物毒性和致毒机理。从蚯蚓个体水平上研究了TBBPA污染对蚯蚓的急性毒性和亚慢性毒性。获得了TBBPA的急性毒性半致死浓度LC50为：TBBPA滤纸接触法LC504.90 mg·L-1(48 h)和人工土壤法LC5016.7 mg·kg-1(14 d)。研究发现TBBPA对蚯蚓的生长和生殖产生明显的影响，蚯蚓的生长率在0.05mg·kg-1TBBPA时就明显抑制蚯蚓的生长，比蚯蚓的存活率、产茧数以及平均产茧重量都要敏感，更能反映出蚯蚓对于TBBPA污染胁迫的响应。然后研究发现TBBPA对蚯蚓的毒性机制主要是通过诱导蚯蚓机体产生活性氧自由基，证明TBBPA诱导赤子爱胜蚓产生的是·OH自由基，产生氧化应激。自由基攻击蚯蚓的细胞膜、线粒体膜，造成脂质过氧化使得MDA含量增加，膜的通透性增大，溶酶体膜的稳定性降低，蚯蚓溶酶体的NRRT明显缩短；攻击细胞里的核酸，DNA又把遗传信息通过mRNA表达出来，因此出现一些抗氧化或抗胁迫基因(SOD、CAT、HSP70等)出于机体自身防御而产生显著诱导表达；攻击蛋白质，产生蛋白质氧化损伤，蛋白质羰基PCO含量显著增加，纤维素酶的活力也显著降低，机体的生理功能受到了损伤。机体内的抗氧化酶SOD、CAT、GST和HSP70出现显著诱导，对自由基进行防御。
由于接触和蓄积毒性的影响使得机体的生理功能逐渐受到损伤，应用扫描和透射电镜观察TBBPA对蚯蚓表皮的影响，发现蚯蚓表皮的节间沟、刚毛等褶皱明显增多，蚯蚓肠道粘膜上皮细胞出现胞内空腔，胞质自溶等现象，产生一些炎症，使得一些清除自由基的抗氧化酶系的细胞器受到破坏，影响了抗氧化酶的分泌，抗氧化防御能力逐渐削弱，机体处于氧化应激状态；当机体处于氧化应激状态时很容易产生细胞凋亡，通过运用流式细胞术发现TBBPA胁迫下蚯蚓体腔细胞在较高的剂量组产生了细胞凋亡。从蚯蚓的分子水平上运用Real-time PCR技术研究了TBBPA污染对蚯蚓体内SOD、CAT、HSP70、p53基因的表达情况，发现抗氧化酶SOD和CAT的基因表达与抗氧化酶的变化趋势基本一致，HSP70是体内清除自由基的一道重要防线，其响应非常敏感，结果显示污染物对蚯蚓mRNA水平上的影响可能是其致毒的首要原因。
抗氧化酶SOD，CAT和NRRT最为敏感，在暴露浓度为0.01 mg kg-1时显著升高，此外，ROS、MDA、PCO、GST以及SOD、CAT和HSP70基因的变化也都非常敏感，可以一起考虑作为TBBPA胁迫下敏感的蚯蚓生物标志物。综合比较，各生理生化指标表明TBBPA对蚯蚓蓄积的可能的毒性阈值在0.01-0.05 mg kg-1之间。
2、Cd污染对蚯蚓的生物毒性和致毒机理。从蚯蚓个体水平上研究了Cd污染对蚯蚓的急性毒性和亚慢性毒性。获得了Cd的急性毒性半致死浓度LC50为：Cd滤纸接触法LC501084 mg·L-1(48h)和人工土壤法LC50834 mg·kg-1(14d)。研究发现Cd对蚯蚓的生长和生殖产生明显的影响，Cd暴露下蚯蚓的生长率在浓度为0.5 mg·kg-1 Cd时，明显抑制了蚯蚓的生长，比蚯蚓的存活率、产茧数以及平均产茧重量都要敏感，更能反映出蚯蚓对于Cd污染胁迫的响应。研究发现Cd对蚯蚓的毒性机制主要是通过诱导蚯蚓机体产生活性氧自由基，采用PBN捕获-电子顺磁共振技术，证明Cd诱导赤子爱胜蚓产生的是·OH自由基，自由基的产生和积累进一步诱导了膜脂质过氧化和蛋白氧化损伤，溶酶体膜的稳定性降低，蚯蚓溶酶体的NRRT明显缩短，纤维素酶的活力也显著降低，机体的生理功能受到了损伤。机体内的GSH和HSP70非常敏感，在Cd胁迫早期就出现显著诱导，对自由基进行防御，之后金属硫蛋白MT和抗氧化酶一起对自由基进行防御。运用流式细胞术研究发现Cd胁迫下蚯蚓体腔细胞在较高的剂量组产生了细胞凋亡。运用Real-time PCR技术研究TCd污染对蚯蚓体SOD、CAT、HSP70、MT、p53基因的表达情况，发现抗氧化酶SOD和CAT的基因表达与抗氧化酶的变化趋势基本一致，MT在重金属胁迫下具有很好的特异性，HSP70作为防御重金属胁迫下产生的自由基非常敏感，结果显示污染物对蚯蚓mRNA水平上的影响可能是其致毒的首要原因。
SOD基因、HSP70、GSH、ROS、PCO、NRRT非常敏感，MDA、CAT、纤维素酶也较为敏感，可一起作为Cd胁迫下潜在的蚯蚓生物标志物。综合比较各生理生化指标，外源性Cd对蚯蚓可能的毒性阈值在0.05-1.0 mg·kg-1之间。
3、初步探索TTBBPA-Cd复合污染对蚯蚓的生物毒性和致毒机理。从蚯蚓个体水平上研究了TBBPA-Cd污染对蚯蚓的急性毒性和亚慢性毒性。复合污染(300 Cd、900Cd、1500 Cd)人工土壤法的LC50均小于单一TBBPA污染，LC50分别为9.79 mg·kg-1，8.65 mg·kg-1和2.11 mg·kg-1。研究发现TBBPA-Cd复合污染对蚯蚓的急性毒性比单一TBBPA污染的毒性强，且主要是以TBBPA的毒性效应为主，毒性随着重金属Cd暴露浓度的增加而增加。复合污染暴露对蚯蚓的存活率、生长率以及生殖有一定的影响，复合污染暴露浓度越大，对存活率和生长率的影响越大，对蚯蚓的生殖毒性越大。与上述单一污染相同，TBBPA-Cd复合污染也诱导蚯蚓产生了自由基，引起了氧化应激，并且产生了氧化损伤。TBBPA-Cd复合污染的交互作用与Cd浓度有关，与单一TBBPA组相比，Cd存在可降低TBBPA的毒性，TBBPA和Cd的交互作用可能属于拮抗作用。研究还表明，TBBPA可降低Cd的生物可利用性。蚯蚓纤维素酶的活力随着暴露时间的延长以及复合污染中Cd浓度的升高逐渐降低，与单一TBBPA暴露相比，复合污染对蚯蚓机体生理功能的影响更为明显。
GSH、ROS、PCO、MDA、SOD、CAT、纤维素酶等都较为敏感，可一起作为TBBPA-Cd胁迫下潜在的蚯蚓生物标志物。综合结果表明，TBBPA-Cd复合污染导致氧化损伤可能的毒性阈值为0.01-0.05 mg·kg-1TBBPA-Cd50 mg·kg-1和0.05-0.1TBBPA-Cd5 mg·kg-1。