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百合为世界四大切花之一,在世界各地广为栽培。但百合是一种较易感病的花卉,植物病害频发的今天,培育优良的百合抗性品种,仍然是发展百合产业的紧迫任务。本课题采用百合不同杂种系的11个不同品种,进行离体条件下组间杂交的授粉试验,对其花粉活力、授粉方法和杂种胚挽救等几方面进行研究,以期克服组间不亲和性。并对亲本和杂交种等21个抗病性不同的百合品种,根据植物抗病基因具有的高度的保守区域的序列设计引物,进行抗病基因同源序列片段的克隆、测序分析,主要研究结果如下:
(1)在常规授粉方法、柱头切割、柱头嫁接和子房切段4种授粉方法中,采用切割子房直接授粉的方式较容易克服受精前障碍,授粉较易成功。影响组间杂交成败的因素还有其亲本之间的亲和性以及受精后胚和胚乳发育的障碍。
(2)L×O组合(L.Snow Queen×L.Sorbonne,L.Snow Queen×L.Marco Polo)杂交成功,并通过组织培养和胚挽救技术,对杂交种子进行了无菌萌发、继代增殖、生根培养,成功获得了再生植株。
(3)应用同源序列克隆法,根据已知抗病基因的保守区域设计3对简并引物,分别提取百合的DNA和RNA,反转录得到cDNA并进行PCR扩增,对回收的片段连接pEASY-T1载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选、菌落PCR以及质粒酶切验证,获得202个阳性克隆。经测序分析,最终在21个百合品种中得到102条具有完整开放读码框的序列。
(4)将得到的克隆序列采用美国国立生物技术信息中心BLAST程序及DNAMAN软件进行分析发现:所有的序列均不包含NBS类保守结构域,和已克隆的部分植物抗病基因(水稻XAL、拟南芥RPS2、烟草N、亚麻L6等)在碱基序列和氨基酸序列上相似性也比较低(1.50%~18.92%),而克隆片段之间存在很高的相似性(36%~100%)。如何进一步对这些克隆序列进行筛选还有待研究。用现有的简并引物没有在百合材料中克隆到所期望的RGAs片段,其原因有待更多的研究和探索,也是后续工作之一。