论文部分内容阅读
目的：脓毒症是对人类健康、经济生活、社会生活造成严重威胁的疾病之一。众多学者对脓毒症所致多器官损伤的机制已有广泛研究,如：肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、脑等,但对于消化系统的鲜有报道。胃肠道不仅是食物消化吸收的场所,更是人体内的细菌库,近些年逐渐认识到在脓毒症的发生发展中胃肠道所发挥的重要作用,小肠作为机体脓毒症的始动器官,更是成为新的治疗靶点。二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)存在于哺乳动物的粘膜和绒毛上层,大部分存在于小肠粘膜绒毛,极少部分存在于子宫内膜绒毛。是具有高度活性的细胞内酶,是反映小肠粘膜功能及结构完整性的较为理想的指标。通过测定血清和小肠组织中DAO活性变化,来反映小肠粘膜屏障的功能,尤其可在无创情况下测定血清DAO活性来反映肠道的损伤及其修复情况。大黄被认为在治疗全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等方面有明显效果。本研究旨在通过测定各组脓毒症大鼠血清DAO水平、肠组织匀浆DAO水平及血清TNF-α来揭示大黄对脓毒症大鼠发挥保护作用之机制、疗效。以期指导临床用药,降低脓毒症患者的死亡率、改善脓毒症患者的预后、减少脓毒症患者的经济负担。方法：实验动物分组：成年、健康SD大鼠84只,购自河北医科大学实验动物中心(合格证编号1303144),雌雄各半,按随机数字法分为五组,分别是1空白组6只、Ⅱ假手术组6只(对照组)、Ⅲ盲肠结扎穿孔(CLP)组24只、Ⅳ大黄治疗组24只、V乌司他丁治疗组24只。又将Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组经随机数字表法分为四个时相组,盲肠结扎穿孔(CLP)后6h、CLP后12h、CLP后24h、CLP后48h、每时相组6只。实验前准备：将各组大鼠于实验前分别称重,并按大鼠编号分别记录。大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)模型制备：实验室温度控制在24-26℃,湿度在35～45%。将麻醉好的大鼠固定于试验台上,取大鼠仰卧位,75%酒精消毒腹部备皮区,在无菌状态下行腹部正中切口,约1.5cm,逐层打开腹腔,探寻盲肠并将其拉出腹腔。小心游离盲肠末端肠系膜(一定要避免出血,否则极易缩短大鼠复苏后的生存时间),将盲肠内粪便轻轻推入直肠内(同一批鼠,要保证盲肠结扎端内粪便残余量基本一致,确保实验大鼠脓毒症的一致性),距离回盲部1.5cm处用4号丝线,避开盲肠动、静脉,在血管弓内侧结扎(保证每只大鼠被结扎的盲肠长度基本一致),结扎完毕仔细检查,保持肠道通路正常。以18号针头在距离回盲部1cm处穿刺3次,可见少量肠内容物流出。将盲肠还纳入腹,逐层关腹。术毕,皮下注射生理盐水3ml/100g补充体液丢失。术后暖灯照射下复苏1.5-2h左右,大鼠苏醒,可自由进食饮水。以术后大鼠出现精神倦怠、少动、寒战、腹胀、眼角分泌物增多、竖毛,测肛温<34℃,处死后可见腹腔有血性渗液,盲肠肿胀、变黑、粘连,空肠肠管胀气等表现,确定脓毒症造模成功。标本采集与保存：采取眼球取血法采血4ml,并将其置于普通塑料试管中,静置约30mmin,待其自然凝固,析出血清,以3000转/min离心l0min,然后取上层血清约1.5m1,移至Eppendorf管中,-70℃冰箱保存待用。开腹,距回盲部10cm处留取小肠组织5cm,将其纵行剖开,于冰生理盐水漂洗,除去血液、肠道内容物,滤纸吸干,称取1g小肠组织,置于10ml的小烧杯,加入0.86%冰冷生理盐水6m1剪碎组织后倒入玻璃匀浆器,再用3m1冰生理盐水冲洗残留组织,一起倒入匀浆管中,充分研碎,以制成10%组织匀浆,置于4℃离心机中,以12000r/min离心12分钟,然后用移液器取上层匀浆液约1.5m1,移至Eppendorf管中,-70℃冰箱保存待用。指标检测：采用ELISA双夹心抗体法,分别检测每组大鼠四个时相组血清TNF-α、DAO及肠组织匀浆DAO含量。统计方法：所有数据采用x±s表示。用SPSS13.0软件进行数据处理,采用方差分析和独立样本t检验进行统计学分析,以P<0.05为有统计学意义。结果：1血清二胺氧化酶(DAO)浓度分析模型组血清DAO含量总体高于假手术组(P<0.05)；模型组血清DAO含量造模后时间变量影响,24h组、48h组与6h组、12h组有显著统计学差异(P<0.01),于6h开始升高,12h内持续升高,于24h达高峰,48h维持在较高水平。大黄治疗组、乌司他丁组6h、12h血清DAO浓度与模型组相比无统计学差异(P>0.05)；大黄治疗组、乌司他丁组24h、48h组DAO浓度与模型组相比显著降低有统计学差异(P<0.01)。两治疗组各时间点血清二胺氧化酶(DAO)浓度相比无统计学差异(P>0.05)。2肠匀浆DAO浓度分析各组各时间点肠匀浆二胺氧化酶(DAO)浓度相比均无统计学差异(P>0.05)。3血清TNF-α浓度分析血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度在造模后6h达高峰(57.6士7.9),12h浓度降低(49.4士2.8),有统计学差异(P<0.05),24h浓度明显降低(23.3±3.1),有统计学差异(P<0.01),48h保持在较低水平(28.6士6.4)。大黄治疗组、乌司他丁组各时间点血清TNF-α浓度与模型组相比,6h组明显降低,有显著统计学差异(P<0.01),12h组仍明显降低,有统计学差异(P<0.05),24h组、48h组无统计学差异(P>0.05)。大黄治疗组与乌司他丁组各时间点血清TNF-α浓度相比无统计学差异(p>0.05)。结论：1大鼠盲肠结扎穿孔后血清DAO水平于6h开始升高,12h内持续升高,24h达高峰,48h维持在较高水平。2大鼠盲肠结扎穿孔后血清TNF-α水平于6h达高峰,12h开始回落,24h后明显下降落,48h保持在一个较低的水平。3大鼠盲肠结扎穿孔后肠匀浆DAO水平于各组均无变化。4大黄及UTI可以显著降低大鼠盲肠结扎穿孔后血清DAO、TNF-α水平,从而减轻全身炎症反应综合症的发生发展；经统计学分析,两者在治疗脓毒症方面疗效相近。