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巴斯德毕赤酵母Gs115(Pichia pastoris)作为一种能够产生多不饱和脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的酵母菌株,是构建产多不饱脂肪酸的基因工程菌株的较好选择。因此,有必要对毕赤酵母多不饱和脂肪酸的合成途径及其合成途径中相关酶类进行系统的研究。
为研究巴斯德毕赤酵母中多不饱和脂肪酸的合成机制,根据已报道的真菌来源的ω3-脂肪酸脱氢酶和毕赤酵母△12-脂肪酸脱氢酶同源序列中保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,结果得到全长为564bp,编码187个氨基酸的片段。通过其编码的氨基酸序列的相似性搜索表明,所扩增片段为新的潜在的ω3-脂肪酸脱氢酶基因的部分DNA序列。在此基础上,采用接头PCR的方法共得到全长为2259bp的核苷酸序列信息,其中包括1248bp的氨基酸编码区和924bp的潜在上游启动子区。同其他已报道的ω3-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列对比的结果和系统进化分析结果都表明：该序列可能编码一个完整的ω3-脂肪酸脱氢酶。为了验证所获得序列的功能,将潜在的编码序列转化到INVSc1受体菌中进行表达。通过气相色谱(GC)和气质联用(GC-MS)分析表明：该序列所编码的蛋白具有ω3-脂肪酸脱氢酶活性,能催化外源性底物亚油酸转化成α-亚麻酸。该基因序列已经注册到NCBI的GenBank中(序列接收号为EF116884)。为进一步验证该ω3-脂肪酸脱氢酶的底物特异性,分别加入不同的n-6类不饱和脂肪酸作为底物进行诱导表达。结果发现PPω3不仅能够识别亚油酸作为底物进行催化,也能够催化γ-亚麻酸、二高γ-亚麻酸和花生四烯酸生成相应的n-3类产物,且催化活性大致相同。这说明毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶对于十八碳和二十碳底物的有着同等的利用能力。
利用同源重组介导敲除的办法构建了巴斯德毕赤酵母△12-脂肪酸脱氢酶基因缺失突变株和ω3-脂肪酸脱氢酶基因缺失突变株,并对缺失突变株的总脂肪酸进行了GC分析和Southern杂交验证。分析结果证明△12-脂肪酸脱氢酶是巴斯德毕赤酵母中唯一催化油酸生成亚油酸的酶类,巴斯德毕赤酵母中只有ω3-脂肪酸脱氢酶一种催化亚油酸生成α-亚麻酸的酶类。因此我们可以进一步推断出巴斯德毕赤酵母体内多不饱和脂肪酸的代谢途径是：首先由△12-脂肪酸脱氢酶催化油酸生成亚油酸,然后ω3-脂肪酸脱氢酶催化亚油酸最终生成α-亚麻酸。分别将巴斯德毕赤酵母△12-脂肪酸脱氢酶基因和ω3-脂肪酸脱氢酶基因转入相应的缺失突变株中进行表达,总脂肪酸成分分析结果发现△12-脂肪酸脱氢酶基因和ω3-脂肪酸脱氢酶基因的表达不仅可以弥补脱氢酶基因缺失突变株中相应基因的缺失,而且回补株中缺失基因的产物占总脂肪酸的百分含量都相应的有所提高。因此认为：通过缺失多不饱和脂肪酸脱氢酶基因构建突变株,然后再将相应多不饱和脂肪酸脱氢酶基因置于强启动子后回补其突变,从而获得高产相应多不饱和脂肪酸脱氢酶产物的工程菌株,是一种值得尝试的构建产多不饱和脂肪酸基因工程菌株的方法。利用膜蛋白结构预测系统TMHMM Server V.2.对巴斯德毕赤酵母的ω3-脂肪酸脱氢酶和△12-脂肪酸脱氢酶进行结构分析,并且参照前人对膜整合的脂肪酸脱氢酶结构与功能关系的研究结果,确定△12/ω3-脂肪酸脱氢酶中三个组氨酸保守区所在的亲水区和C端游离区所在的位置。构建将ω3-脂肪酸脱氢酶基因的该部分序列替换成△12-脂肪酸脱氢酶基因中相应序列的嵌合体,并将其转入酿酒酵母中进行表达,发现以ω3-脂肪酸脱氢酶为母体的嵌合体失去了ω3-脂肪酸脱氢酶的活性,反而具有了△12-脂肪酸脱氢酶的催化功能。因此推断出决定巴斯德毕赤酵母膜整合的ω3-脂肪酸脱氢酶脱氢机制的氨基酸序列属于脂肪酸脱氢酶中三个组氨酸保守区所在的亲水区和C端游离区。进一步的比对巴斯德毕赤酵母和克鲁维氏酵母中处于三个组氨酸保守区所在的亲水区和C端游离区的ω3-脂肪酸脱氢酶/△12-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列,选出酵母中具有ω3-脂肪酸脱氢酶/△12-脂肪酸脱氢酶酶种类保守性的7个氨基酸位点和处于C端的22个极不保守的氨基酸位点进行突变。利用搭桥PCR的方法构建突变体,将其转入酿酒酵母中进行表达,发现以ω3-脂肪酸脱氢酶为母体的突变体同样失去了ω3-脂肪酸脱氢酶的活性,反而具有△12-脂肪酸脱氢酶的催化功能。可以得出结论：对于膜整合的巴斯德毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶而言,具有酶种类保守性的7个氨基酸位点和处于C端的22个极不保守的氨基酸位点对于决定脱氢机制起主要作用。