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研究背景相对于机械瓣膜和普通生物瓣膜来说，组织工程心脏瓣膜（TEHV）自身有很多优点，但目前TEHV的最大缺点是植入人体后难以耐受高速高压的血流冲击，功能上难以满足需要，且容易衰坏，使用寿命短。其主要原因是种子细胞如骨髓间充质干细胞（MSCs）在高剪应力下难以存活，不能对TEHV组织结构进行保护和修复，因此提高高剪应力条件下的细胞存活及改善其生长状态研制TEHV的关键方向。人体内血流动力是瓣膜发育的重要起始信号，并在瓣膜发育过程中通过力的大小变化对瓣膜组织结构和功能进行调节[1-2]。从胚胎期至成人，人体内的流体力是逐步增加的，因此研究渐进增加的流体力对TEHV种子细胞的生物学效应具有重要意义，并可能通过渐进增加的流体力训练从而实现TEHV对高速、高压血流的耐受.研究目的本课题研究渐进性增加的剪应力对MSCs生长状态的影响及其可能的作用机制，并研究渐进性增加剪应力对MSCs进行流体力适应性训练的结果。研究方法和结果第一部分：将大鼠MSCs在0、1、3、8、15dyn/cm~2剪应力水平分别作用24h，观察细胞生长状态变化，并通过MTT、流式细胞技术、Hoechst/PI、透射电子显微镜等检查方法观察MSCs的生长状态和凋亡、坏死情况。结果：1dyn/cm~2剪应力对MSCs无明显影响，3dyn/cm~2的剪应力可以促进细胞生长，而8和15dyn/cm~2的剪应力促使细胞凋亡明显增多。说明合适的剪应力（3dyn/cm~2）对细胞生长有益，而细胞不能耐受高的剪应力作用（8和15dyn/cm~2）。第二部分：以渐进增加的剪应力作用于MSCs，设相应的剪应力高值为对照组，观察细胞生长状态变化，通过MTT测定细胞增殖及活性，流式细胞技术测定细胞死亡百分比。取作用后的细胞培养基，以酶联免疫吸附测定法（Elisa）检测其中细胞生长因子bFGF、TGF-β1、PDGF、VEGF变化，根据生长因子浓度变化制作相应的载药纳米微球，加入培养基。结果：渐进增加的剪应力相较于恒定高剪应力（8和15dyn/cm~2）显著改善了细胞增殖及活力，降低了细胞死亡百分比，并且相较于高剪应力组使细胞生长因子分泌水平升高。载药纳米微球的使用可以改善力作用后的细胞存活。说明渐进性力学训练可以改善MSCs对高剪应力的耐受，改善因高剪应力作用导致的细胞因子分泌减少，通过纳米微球载生长因子缓释系统可以增强力作用后的细胞存活。第三部分：以0、1、3、8、15、1-15dyn/cm~2的剪应力作用于MSCs，通过Western方法测定ERK磷酸化（P-ERK）以及JNK（c-JunN-terminalkinases）底物c-Jun的磷酸化水平，即P-c-Jun的水平。结果：高剪应力（8和15dyn/cm~2）减低了P-ERK，而增加了P-c-Jun的表达。而1-15dyn/cm~2渐进性增加的剪应力相较于高剪应力可以升高P-ERK水平，降低细胞内P-c-Jun的水平。说明剪应力对MSCs的促生长、凋亡作用可能通过ERK和JNK通路进行。第四部分：设计可以模拟人体血流的仿生脉动生物反应器。将1-15dyn/cm~2渐进增加的剪应力预训练过的MSCs种植于脱细胞的猪主动脉壁上（预训练组），对照组接种静态培养的MSCs。将两组均固定于体外脉动反应器，在15dyn/cm~2水平作用72h。取标本进行苏木素-伊红染色（HE），同时以分光光度法和电泳测定组织内DNA含量，以western方法检测组织内I型胶原含量。结果：研制成仿生脉动生物反应器，可以输出近似于心脏血液循环特征的搏动性血流，可持续稳定运转72h。HE结果显示在15dyn/cm~2剪应力作用72h后，训练组的MSCs在动脉壁内留存较多，而对照组的MSCs从动脉壁基本脱落。分光光度法及电泳显示训练组组织内DNA含量明显高于对照组。Western检测I型胶原含量训练组明显高于对照组。说明力学训练后的MSCs相对于静态培养的MSCs接种于支架材料后可较好耐受高速、高压流体力的作用。结论本研究系统地研究了不同大小剪应力对MSCs的作用，发现适度的剪应力（3dyn/cm~2）促进MSCs生长，过低的剪应力（1dyn/cm~2）对MSCs生长无明显影响,而过高剪应力（8、15dyn/cm~2）抑制MSCs生长并促使细胞死亡。首先提出了对MSCs进行渐进性增加剪应力训练的概念，发现渐进性增加的剪应力相较于恒定高剪应力更容易被细胞耐受，细胞活力增强、存活比例增加、MSCs分泌细胞生长因子增加。探索了剪应力对MSCs作用的机制，发现ERK和JNK通路可能参与剪应力对细胞生长、凋亡的调控机制。将受剪应力预训练的MSCs接种于脱细胞猪主动脉壁在仿生脉动生物反应器内受高水平流体力作用后，MSCs可以较未受力训练的MSCs更好地存活和附着，并能分泌胶原蛋白而发挥组织重塑功能。