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结核病(TB)是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，是威胁人类的三大感染性疾病之一。全球约有1/3的人口感染结核菌，每年约有200万人死于结核病。巨噬细胞是抗击 Mtb的第一道防线，是机体抵抗结核分枝杆菌的主要场所，也是结核分枝杆菌的主要寄居细胞。巨噬细胞可以吞噬病原体，分泌多种细胞因子并启动炎症反应，产生ROI、RNI、抗菌肽等方式杀灭结核杆菌，同时巨噬细胞的自噬与凋亡也在清除结核分枝杆菌的过程中发挥重要的作用。结核分枝杆菌是生存于吞噬细胞中的胞内菌，经过长期进化也产生了多种抗衡手段，如抑制巨噬细胞吞噬体与溶酶体的融合，抑制细胞自噬与凋亡的发生等。这些功能主要通过结核分枝杆菌自身表达的毒力蛋白来实现。EspR(Rv3849)是结核分枝杆菌的一个毒力因子，其大小约为14.7kDa，能够促进结核分枝杆菌在巨噬细胞中的生存。根据Raghavan等报道，EspR与Rv3616c-Rv3614c（EspACD）操纵子结合并激活其转录，表达产物能够激活ESX-1系统的分泌。有趣的是，EspR蛋白本身也被ESX-1系统分泌到细菌外，以负反馈的方式调节ESX-1分泌系统的活性。用外泌的方式来调节蛋白活性在细菌中并不普遍，因此我们怀疑被分泌到细菌外的EspR蛋白在宿主细胞中还有其它功能。目前，EspR蛋白与宿主细胞间有无相互作用，作用机制是如何建立的尚未有报道。如果EspR有抑制宿主免疫功能的作用，则有可能成为结核病药物研发的新靶点。 因此本文旨在研究EspR在宿主细胞中发挥的功能。在本研究中，我们通过分子生物学技术，构建上调表达质粒pMSCV-eGFP-EspR，包装逆转录病毒感染RAW264.7细胞，构建了表达EspR的巨噬细胞稳转株（RAW264.7-EspR）。为了探究EspR对巨噬细胞免疫功能的影响，我们用BCG刺激RAW264.7-EspR及对照细胞系RAW264.7-Vector后，用Real time PCR、ELISA及Western blot等方法检测了多种炎症介质的表达，发现EspR能够抑制IL-1β、IL-6及iNOS在巨噬细胞中的表达；为了进一步探讨EspR抑制巨噬细胞炎症反应的具体机制，我们用BCG刺激RAW264.7-EspR及RAW264.7-Vector，检测了NF-κB，MAPK信号通路中相关信号分子的磷酸化水平，结果表明EspR蛋白能够抑制NF-κB和MAPK信号通路中信号分子p65、IKK、Erk1/2、SAPK/JNK、p38的磷酸化。由于EspR蛋白能够同时抑制NF-κB和MAPK信号通路，我们继续检测了两通路共同的上游相关分子，结果发现EspR能够通过降低IRAK1的磷酸化而抑制BCG激活的TLR信号通路。同时我们也用Annexin-V/7-AAD以及Western blot的方法初步检测了EspR对巨噬细胞凋亡的影响，发现EspR能够抑制BCG诱导的巨噬细胞外源性凋亡，其具体机制还需进一步探讨。 综合上述结果表明，在巨噬细胞中EspR能够抑制TLR介导的信号通路，降低炎症介质IL-1β、IL-6及iNOS的表达，同时抑制巨噬细胞凋亡，从而阻止了巨噬细胞对Mtb的杀伤。