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母猪的生产能力是影响养猪生产企业经济效益的重要因素,提高情期受胎率、窝均仔猪头数和年产窝数是提高母猪生产能力的有效手段。环鸟苷酸cGMP作为含氮类激素第二信使,在促进哺乳动物血液循环,改善子宫内环境,减少或克服胚胎发育迟缓,甚至胚胎死亡等方面具有十分重要的作用。磷酸二酯酶5(phosphodiesterase type five,PDE5)是一类参与调节cGMP特异性信号通路的关键酶,是特异性的cGMP水解酶,通过水解胞浆中的cGMP来抑制平滑肌的松弛,改善血液循环。目前,已发现的3种PDE5同工酶,它们在人PDE5基因序列的的5端调控区存在差异,因此,研究猪PDE5基因启动子区,对了解其复杂的结构和功能,以及提高母猪繁殖能力方面具有十分重要的指导意义。
本研究通过PCR扩增和比对验证的方法,克隆获得PDE5基因的5端调控区序列1528 bp,通过生物信息学方法分析并预测潜在的转录结合因子结合位点,根据预测结果构建了5个启动子缺失片段检测载体A1(-1195～+297),A2(-794～+297),A3(-556～+297),A4(-341～+297),A5(+87～+297),将所有载体分别转染猪胎儿成纤维细胞PFF,检测其不同缺失体的启动子活性,获得其重要的转录活性核心区域。本研究主要的结果如下:
1.克隆获得猪PDE5基因启动子和部分第一外显子序列长度1528 bp,并与人、牛和马保守区域比对,同源性分别达到81％、83％和86％。同时克隆了猪部分cDNA的部分序列975bp,与人和鼠PDE5基因的同源性分别达到85％和81％。
2.通过生物信息学分析,发现在转录起始位点附近有多个转录因子结合位点:CACCC-box,GC-box,E-box,以及RNAase Ⅱ factors、Sp2、cAMP binding proteins和Sp1因子等多个潜在的转录因子,这些转录因子结合位点或转录因子可能对PDE5基因的转录活性调节有着十分重要的作用。
3.生物信息学预测结果提示在猪PDE5基因启动子-546～-343、,-240～-52和-19～+93区域存在三个CpG岛,可能会对启动子的活性产生不同程度的影响。
4.通过T-A克隆和双酶切方法,将五个启动子缺失片段成功构建至启动子活性检测载体,萤火虫荧光素酶活性检测结果表明A4载体启动子片段(-341～+297)具有最高的转录活性,说明在该区域存在调节PDE5基因重要的核心元件或核心区域。而A1载体启动子片段(-1195～+297)转录活性最低,说明在该区域可能存在对PDE5基因表达的负调控元件。A5载体启动子片段(+87～+297)基因表达也存在较高的活性值,其转录活性区域还需要进一步深入研究。