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FMRF酰胺类多肽（FMRFamide-like peptide,FLP）,是已知的最大和最多样的神经肽家族。FLP介导神经信号传递系统,与寄生线虫的运动和感觉功能密切相关。研究植物寄生线虫FLP,对于了解植物寄生线虫的致病机理,探讨防治植物寄生线虫新途径具有重要意义。β-1,4-葡聚糖酶的主要功能是降解纤维素,引起植物细胞形态和功能上的变化,从而提高线虫在寄主中的寄生能力。编码这些分泌物的基因被看作是寄生基因,克隆这些基因是了解线虫侵染机制的基础。因此,本研究分别从两大外来入侵的植物寄生性线虫松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）和相似穿孔线虫（Radopholus similis）中分离得到FMRF酰胺类多肽基因和葡聚糖酶基因,并进行了较详细的研究,主要研究如下:1.利用生物信息学筛选靶标基因的EST序列,采用RACE法从松材线虫体内获得了9个flp基因的cDNA全长和一个cDNA片段（Bx-flp-3b）,并进行深入分析。这9个flp基因分别是Bx-flp-1,Bx-flp-2,Bx-flp-3a,Bx-flp-6a,Bx-flp-6b,Bx-flp-6c,Bx-flp-6d,Bx-flp-12,Bx-flp-14,其登陆号分别为EU026161,EU930826,EF422867,FJ151415,FJ151416,FJ151417,FJ151418,EF422868,EF622046。从基因结构上分析发现Bx-flp-1由4个外显子和3个内含子组成:Bx-flp-3a由2个外显子和一个内含子组成;Bx-flp-6基因发生两种不同的剪辑方式,剪切方式分别发生在中间和C端,产生了4种不同的选择性剪切异构体。用Tail-PCR的方法分别得到3个基因的5’侧翼序列,大小分别为857bp、377bp和1630bp。2.利用原位杂交的方法将6个flp基因进行定位,发现Bx-flp-1和Bx-flp-3a主要在松材线虫的咽坏和头部表达,Bx-flp-2,Bx-flp-3b,Bx-flp-6a～d,Bx-flp-14主要在松材线虫的尾部表达;而Bx-flp-12的表达模式比较复杂。3.体外合成Bx-flp基因片段的dsRNA,利用浸泡法处理松材线虫,对其进行离体干扰效应验证。QPCR分析表明干扰后的靶标基因Bx-flp-1,Bx-flp-3a,Bx-flp-6转录水平明显降低,只达到对照的22%、41%、29%,达到差异显著（P＜0.05）。显微镜观测干扰后线虫活动能力明显下降,呈现僵直和假死状态。但是,40℃放置1hr后,僵直的线虫又能恢复活动能力。繁殖能力检测发现,干扰松材线虫Bx-flp-1,Bx-flp-3a,Bx-flp-6不能抑制其繁殖。4.用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Rs-eng-1（GenBank登录号为EU414839）。此cDNA全长序列为1630bp,包括1个1404bp的完整ORF,编码含467个氨基酸的蛋白,其理论分子量与等电点分别为48.22KD,pI为6.04。序列分析表明含有糖基水解酶GHF5的保守结构域,N端具有22个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域（CBDⅡ）。原位杂交结果显示此基因由穿孔线虫的食道腺分泌。Southern分析为多拷贝基因。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含6个内含子,切割点符合5‘-GT...AG-3’的规律。进化分析表明,与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测其来源于细菌的水平基因转移。5.分别构建了pET-28（a）-Rs-eng-1,pET-42（a）- Rs-eng-1,pGEX-6P-1-Rs-eng-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导表达,没有发现特异条带。引入EcoRⅠ和pstⅠ两酶切位点构建表达载体,获得表达菌株pMAL-c2X-Rs-eng-1（BL21）,诱导表达后出现包涵体。因为包涵体没有活性,故重新构建了酵母表达载体pPIC9K-Rs-eng-1,电击转化酵母细胞,利用甲醇诱导,发现Rs-eng-1在酵母中大量表达并分泌到胞外,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的表观分子量约为60kD。并且表达的蛋白具有降解纤维素的活性。6.离体RNAi香蕉穿孔线虫Rs-eng-1基因。QPCR检测发现Rs-eng-1基因的mRNA丰度显著下降,其表达量只有对照的15%。纤维素酶活性测定结果显示,经dsRNA处理的线虫纤维素酶分解圈平均值为17cm,而对照为22cm,达到显著差异。繁殖率测定,发现RNAi能抑制香蕉穿孔线虫的繁殖,使其生育滞后。分离RNAi处理后接种的香蕉穿孔线虫,发现雄虫比例上升。7.通过植物介导沉默靶标基因对线虫进行RNAi活体效应研究。将Rs-eng-1基因片段分别正向和反向插入到载体中,构建了目的基因的dsRNA干扰植物表达载体pFGC5941-RSENG-RNAi。采用农杆菌介导法转化番茄,获得了dsRNA干扰表达载体的转基因番茄。对转基因番茄进行PCR扩增检测和Southern分析,证明外源基因已成功整合到植物基因组中,RT-PCR验证外源基因高效表达。将香蕉穿孔线虫接种到T1代植株,45d后发现转基因植株的根系中香蕉穿孔线虫侵染的数目明显少于对照,并且干扰效果优于离体RNAi。将根结线虫2龄幼虫接种到T1代植株,25d后检测根结数,发现表达Rs-eng-1基因dsRNA的番茄根结数明显减少,表明转基因番茄具有高效的抗线虫作用。