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目的使用纳米沉淀技术制备负载布洛芬(ibuprofen,IPF)新型温敏凝胶三嵌段共聚物--聚(5-乙二醇缩酮-ε-己内酯-ε-己内酯)-聚乙二醇-聚(5-乙二醇缩酮-ε-己内酯-ε-己内酯)(PECT)。观察其形貌、研究其相转变行为,以及对其药物释放特点进行分析;再通过体外细胞实验测定生物安全性和抗炎效果,评价其释药情况以及生物学性能。旨在为制备既具有局部缓释特点,同时又能起到高效抗炎作用的凝胶提供研究基础。方法1.使用纳米沉淀技术制备负载IPF的PECT缓释凝胶和不载药的空白PECT缓释凝胶;通过扫描电镜(Scanning Electronic Microscope,SEM)、透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察载药与不载药凝胶形貌;采用小瓶翻转方法研究IPF/PECT分散液的相转变行为;体外测定药物释放曲线。2.采用组织块原代培养法培养健康人的牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblasts,HGFs);胰酶消化法进行传代培养;倒置相差显微镜观察HGFs形态以及生长情况;免疫组织化学方法进行细胞来源鉴定,生长良好的第4-6代HGFs用于实验。体外将已制备好的IPF/PECT纳米粒水溶液与HGFs共培养,设置不同药物浓度组(以PECT为标准);用四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl terazolium,MTT)于实验的第48h检测各组HGFs的增殖活性。3.使用牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis-Lipopolysaccharide,Pg-LPS)刺激HGFs,建立细胞炎症模型。体外分别加入相同IPF药物浓度的IPF水溶液和IPF/PECT纳米粒溶液,与炎症状态下HGFs共培养;定时取上清液,用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assays,ELISA)方法检测不同时间点各组HGFs前列腺素E-2(prostaglandin E-2,PGE2)分泌情况。结果1.载IPF纳米粒(IPF/PECT NPs)的物理性状观察:纳米沉淀技术制备负载IPF的PECT缓释凝胶,制成冻干粉储存。IPF/PECT冻干粉溶于双蒸水中配制为IPF/PECT NPs分散液,常温下为溶液状态,将小瓶置于37℃温箱可见溶液一分钟内发生相转变,成为半固体凝胶状态;纳米粒溶液透射电镜显示:IPF/PECT纳米粒粒径均匀,无明显聚合现象;半固体水凝胶扫描电镜显示:IPF/PECT凝胶孔径大小均一,较无载药凝胶孔径稍大,有利于药物释放;药物类似线性释放可达32天以上;药物累积释放量85%,无明显突释现象。2.培养HGFs及其与IPF/PECT纳米粒水溶液共培养结果:采用组织块原代培养法于体外成功培养出HGFs。使用倒置相差显微镜观察,接种7~10d后组织块四周即可见原代细胞游出,呈放射状排列,较多为长梭形,细胞传代后生长迅速,形态与原代细胞相一致。通过细胞来源鉴定,细胞抗角蛋白染色阴性,抗波形丝蛋白染色阳性,同时结合取材部位,证实本实验培养所得细胞为中胚层来源的HGFs。MTT法检测HGFs的增殖活性:不同浓度IPF/PECT与HGFs共同培养48h后,各组平均OD值分别为0.29±0.01、0.28±0.01、0.29±0.02、0.29±0.03、0.29±0.03、0.29±0.03、0.28±0.02,各实验组与对照组相比均无统计学意义(P﹥0.05)。3.不同时间点IPF/PECT与炎症状态下HGFs共培养的上清液中PGE2表达情况:1μg/ml Pg-LPS处理HGFs后PGE2表达显著上升。使用ELISA方法检测炎症细胞上清液中PGE2显示:在不同时间点IPF水溶液以及IPF/PECT NPs,PGE2水平均较对照组低;相同药物浓度IPF/PECT NPs组PGE2水平均低于IPF水溶液组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1.使用纳米沉淀技术可以制备出负载布洛芬的新型双亲性温敏原位凝胶。IPF与PECT质量比为5:100,为最大载药量,形态结构稳定,药物缓释效果良好。2.载药后的PECT新型缓释药物载体在体外对HGFs增殖无影响,具有良好的生物相容性。3.各时间点IPF/PECT与IPF抗炎效果相比,有明显优势,且随着时间的延长,IPF/PECT组的抗炎效果逐渐增强。