中度嗜盐菌来源的相容性溶质资源发掘及合成途径的研究

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相容性溶质具有在于旱、高温、冷冻等逆境中保护细胞和生物大分子的作用。而我国有丰富的极端微生物资源,对这些极端微生物产相容性溶质情况进行研究,可以获得不同的相容性溶质和生产菌菌株以及相关信息,具有一定的开拓意义。我们用HPLC和NMR技术检测了柴达木盆地不同地表深度来源的约400株中度嗜盐菌的相容性溶质积累情况。这些菌株分别隶属于Actinobacteria,γ-Proteobacteria和low G+C革兰氏阳性类群。在半组成型培养基中几乎所有的被测菌株都能大量积累四氢嘧啶和甘氨酸甜菜碱,同时一些菌株还能检测到少量的海藻糖、甘露糖和谷氨酸等其它相容性溶质的存在。同一地表垂直深度分离的同一个类群菌株在主要相容性溶质积累方面相同,而在一些少量积累的相容性溶质方面有一定的差别。不同的地表深度并没有对同类群菌株的这种相容性溶质积累规律产生显著的影响。  在检测过程中,我们对四氢嘧啶高产菌株进行了筛选和优化,最终发现菌株H114B37是四氢嘧啶高产菌株,它能耐受高低盐的反复冲击并且适合细菌挤奶工艺,具有工业应用潜力。摇瓶发酵该菌株得到的四氢嘧啶产率为339.6 mg/(l.d)。同时我们还发现菌株H96B37、 H199B63和Bacillus sp.N16-5具有高效羟化酶EctD。  在检测过程中,我们发现菌株H3B36能积累一种未知相容性溶质。经过鉴定,该物质为Nα-acetyl-α-lysine。对菌株H3B36的系统进化、形态和生长进行研究,发现该菌与Salinicoccus halodurans W24T的16S rDNA序列相似性为99.9%;菌落形态为白色、不透明的圆状,并且带有轻微的凸面,电镜观察为圆形;菌株能在4℃-42℃、2%-18%(w/v) NaCl范围内生长。对不同生长时期、不同盐浓度和不同温度条件下Nα-acetyl-α-lysine的积累情况进行测定,发现胞内Nα-acetyl-α-lysine的积累量在稳定期前期到达最大值并且这种积累会对高盐和高温作出正向的响应,同时外源添加Nα-acetyl-α-lysine会对菌株S.haloduransH3B36的生长起到一定的促进作用。  我们发现菌株S.halodurans H3B36中含有Nα-acetyl-α-lysine从头合成的相关基因。在营养丰富的条件下,细胞可以直接从外界吸收赖氨酸和天冬氨酸合成Nα-acetyl-α-lysine;在寡营养条件下,细胞可以吸收外源的葡萄糖生成天冬氨酸和赖氨酸,进而生成并积累Nα-acetyl-α-lysine。之后我们对Nα-acetyl-α-lysine在菌株S.halodurans H3 B36中的合成途径进行了研究。通过基因组数据,我们发现一个含8个基因(orf_1582-orf_1589)的8kb长的基因簇,该基因簇有可能参与了从天冬氨酸到Nα-acetyl-α-lysine的合成过程。然而从基因组的测序结果中,我们并未找到编码能催化赖氨酸生成Nα-acetyl-α-lysine的酶的基因。我们测定了不同温度条件下S.halodurans H3B36的转录组。转录组数据显示,高温胁迫会造成细胞的全局扰动。当S.halodurans H3B36从30℃转移至42℃后,细胞会采取减少能量和物质的消耗同时增加一些细胞保护物质的措施来抵御外界的高温压力。基因orf_2534编码sigma因子RpoN,它有可能参与了高温下细胞全局扰动的调控。根据转录组信息推测,orf192、orf_193和orf_1259有可能组成一个ABC转运蛋白,并且参与Nα-acetyl-α-lysine合成所需前体物质的运输;基因簇orf_1582-orf_1589中的8个基因、基因orf_2472或orf_1297和基因orf_793有可能参与了从天冬氨酸到Nα-acetyl-α-lysine的生物合成。通过异源表达基因orf_793和体外催化反应,我们证实了该基因所编码的蛋白能在大肠杆菌中催化Nα-acetyl-α-lysine的生成,同时我们发现基因orf_793的导入会对大肠杆菌高温耐受性和高盐耐受性有一定的促进作用。
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