论文部分内容阅读
β-防御素是数十个氨基酸组成的阳离子小肽，具有广谱抗微生物活性，在先天性与获得性免疫中具有一定的作用。β-防御素-2在呼吸道上皮和浆液细胞内呈现诱导性表达，β-防御素-2的缺乏将引起肺囊性纤维化和感染，β-防御素-2肽可能是一种在抗感染和肿瘤免疫调节方面中具有重要作用的新型药物。 目前，从皮肤等上皮组织中提取得到的β-防御素-2多肽的量非常有限，而采用化学合成法得到β-防御素-2多肽的成本较大、三级结构与生物学活性与天然的β-防御素-2多肽相差大，而基因工程用于小肽的生产已有十余年的历史，因此，我们尝试采用基因工程的方式来获得目标产物。但是，基因工程生产β-防御素-2肽技术方法尚未成熟。大肠杆菌由于其生长迅速且有良好的表达系统而被广泛地用作基因工程的宿主菌。大肠杆菌表达系统用于表达β-防御素2有一定的问题存在：其一是由于β-防御素-2抗革兰氏阴性菌的作用，可能对宿主菌产生毒性作用从而破坏了整个表达系统。此外，外源蛋白在宿主菌中可能被宿主菌蛋白酶水解。针对上述两点，我们通过表达融合蛋白来避免β-防御素2的杀伤宿主菌的作用、浙江大学硕士学位论文选择蛋白水解活力相对较低的大肠杆菌菌株来减少外源蛋白的破坏，此外，我们将菌株生长和外源蛋白表达分成不同的阶段，尽量避免以上的不利条件。研究目的利用基因工程技术，构建大鼠p一防御素一2原核表达质粒pET32一rBDZ，研究重组子在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达，为进一步大规模生产D一防御素一2多肤、及p一防御素一2多肤的生物学活性等的研究奠定实验基础。材料与方法取健康SD清洁型大鼠的肺组织;提取组织总RNA，并用逆转录方法获取CDNA，用PCR方法从cDNA中获取目的基因(rBD一2)片段;目的基因rBD一2和载体质粒pET一32纯化后，分别用Ncoll和Hindm进行双酶切并进行连接;连接产物转化感受态大肠杆菌DHSQ，阳性重组子经PCR扩增、双酶切和测序鉴定确定为目标质粒pET一32一rBDZ。阳性重组子转化表达宿主菌BL21(DE3)，培养发酵pET32--rBDZ一BL21(DE3)至对数生长期，加入IPTG诱导其外源蛋白的表达，以western Blotting方法明确原核表达产物的性质。结果浙江大学硕士学位论文RT一PCR方法从大鼠肺组织中获取了大小为1 52bp的基因扩增产物:2.PCR扩增产物成功地接入载体质粒pET一32，经测序显示重组子基因序列及插入方向正确，未出现移码和错码;3.重组子转化表达宿主菌BL21(DE3)，37℃条件下培养经IpTG诱导rBD一2的融合蛋白在大肠杆菌中能得到表达，可溶部分目的蛋白量占了目的蛋白绝大部分，为88.9%，目的蛋白量在整个可溶部分占的比例为62.4%，western blot验证了表达产物为rBd一2的融合蛋白。结论大鼠p一防御素一2(rBD一2)能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到表达，为大规模生产奠定了实验依据，也为其他抗微生物肤的表达、生产提供了一定的借鉴。