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目的:
白藜芦醇(Resveratrol,Res)是一种广泛存在于葡萄、花生等中的非黄酮类多酚化合物,具有调节脂蛋白代谢,抗氧化、抗炎及抗肿瘤等作用。该化合物具有天然、低毒、高效等特点,近年来受到国内外学者的广泛关注,成为一些肿瘤临床治疗新的研究热点,但有关Res对皮肤癌的作用及其机制研究甚少。本课题组前期研究表明:Res对皮肤癌细胞系A431细胞增殖具有明显的抑制作用,引起细胞凋亡,且呈时间.剂量依赖性。本实验的目的旨在探讨Res诱导人皮肤癌细胞株A431凋亡作用的可能信号通路,为临床相关疾病的治疗提供新的实验依据。
材料和方法:
1.Hochest染色细胞核,荧光显微镜观察不同浓度Res作用后,A431细胞的生长状态和凋亡情况,结合四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测Res抑制A431细胞生长的作用。
2.以人皮肤癌细胞株A431为实验对象,实验分为四组:对照组(A组):加与实验组等量的溶剂DMSO:Res组(B组):Res处理,终浓度为15mg/L；Res和JNK蛋白抑制剂SP600125组(C组):SP600125(浓度为4.5mg/L)处理30min后,加入与C组等量的Res(15mg/L)。单纯SP600125组(D组):仅SP600125处理(浓度为4.5mg/L)。细胞培养48h后,相差显微镜观察培养的A431细胞形态；免疫荧光染色、Western blot方法检测Caspase-3、Bax、Bcl-2、JNK以及P—JNK蛋白分布和含量等指标的变化。
结果：
1.Hoechest染核可见,对照组细胞呈弥散均匀荧光,Res处理后,部分A431细胞核呈致密浓染,或呈碎块状浓染。MTT结果显示在一定浓度范围(6mg/L～20mg/L),Res对A431细胞的生长抑制作用随浓度和时间而增加,即呈时间-剂量依赖性。
2.细胞形态变化:对照组(A组)和单纯抑制剂组(D组)的细胞呈梭形或多角形,细胞融合成片状,生长状态良好。Res处理(B组)后,可见部分细胞核固缩,细胞皱缩变圆,与周围细胞的粘附减弱,脱落,悬浮细胞增多；先经JNK蛋白抑制剂SP600125处理,再加入Res组(C组)的细胞状态与对照组相似。经Hoechest复染细胞核可见:A组和D组的细胞核呈弥散均匀荧光,而B组的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状；经SP600125抑制剂处理的C组细胞核的荧光强度和分布与对照组相似。
3.免疫荧光染色:Bax蛋白、Bcl-2蛋白和Caspase-3蛋白主要位于细胞质,P-JNK蛋白主要位于细胞核。Res处理(B组)的Bax蛋白、P—JNK蛋白和Caspase-3蛋白荧光强度明显增加,而Bcl-2蛋白的荧光明显减弱(P<0.05)；经SP600125抑制剂处理(C组),Bax蛋白、P—JNK蛋白和Caspase-3蛋白荧光强度减弱,与此同时,Bcl-2蛋白荧光强度明显增强(P<0.05)。
4.Western Blot分析:蛋白电泳结果与免疫荧光染色相似,Res处理48h(B组)后,Caspase-3和Bax蛋白表达增加,而Bcl-2表达降低(P<0.05),同时,P—JNK蛋白表达明显增加(P<0.05)。抑制JNK蛋白磷酸化(C组)后,P-JNK、Caspase-3和Bax蛋白明显减少(P<0.05),而Bcl-2蛋白明显增加(P<0.05)。
结论：
本研究结果表明:
1.Res对皮肤癌细胞系A431的生长具有明显的抑制作用,能够引起细胞凋亡,且呈剂量-时间依赖性
2.Res处理后,皮肤癌细胞株A431细胞的3NK蛋白磷酸化增加,聚集在细胞核
3.Res能够使皮肤癌细胞株A431表达Bax和Caspase-3蛋白增加,而Bcl-2蛋白表达下降,这种现象可被添加JNK蛋白磷酸化抑制剂所逆转。
由此推测:Res引起A431细胞发生凋亡的可能机制为；首先Res促进细胞内JNK蛋白磷酸化,进入细胞核,后者可能通过抑制Bcl-2蛋白表达,上调Bax和Caspase-3蛋白表达,致使细胞凋亡。