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牛乳促睡眠肽具有不同于传统的中草药促睡眠物质,它来源于酪蛋白酶解液。本研究的实验原料从工厂生产完酪蛋白磷酸肽后的牛乳多肽中获取牛乳促睡眠肽粗提取,借助分离纯化技术及电生理膜片钳方法,得到牛乳促睡眠肽P3和促睡眠肽单体1、单体2、单体3、单体4,然后通过大鼠戊巴比妥钠协同模型,获取P3及其促睡眠产品不但具有缩短大鼠入睡时间、延长大鼠睡眠时间,而且结合大鼠PCPA失眠模型,研究了牛乳促睡眠肽的促睡眠机理。采用LTQ及电生理膜片钳技术,对单体1、单体2、单体3、单体4进行结构鉴定和促睡眠活性探索。同时,将牛乳促睡眠肽结合百合、酸枣仁药食同源的中草药,复配成一款具有较好促睡眠功效的促睡眠产品。(1)牛乳促睡眠肽的分离纯化及结构鉴定通过中高压柱层析、制备液相以及高效分析液相等分离纯化方法,对牛乳促睡眠肽粗提物进行分离纯化。结合LTQ-Orbitrap液-质联用对分离的牛乳促睡眠肽进行结构鉴定。结果表明,牛乳促睡眠肽分离出4个具有较好促睡眠效果的多肽单体,简称单体1、单体2、单体3、单体4,其氨基酸序列依次为:HQGLPQEVLNENLLR、YKVPQLEIVPNSAEER、HPIKHQGLPQEVLN ENLLR和VPQLEIVPNSAEER。该四个单体皆为首次发现的具有较好促睡眠效果的牛乳多肽。(2)应用电生理膜片钳技术研究牛乳促睡眠肽的体外促睡眠活性本研究主要借助大鼠离体脑片,采用电生理膜片钳技术,根据牛乳促睡眠肽对大鼠下丘脑腹外侧视前区神经元的放电特征,探索牛乳促睡眠肽的体外促睡眠活性。结果表明,牛乳促睡眠肽单体1、单体2、单体3、单体4均有较好的促睡眠活性,均具有较好的抑制平均AP诱发的个数,作用后Vm均具有显著性变化。根据抑制VLPO神经元效果对比发现,单体2的抑制效果最好,而单体4的促睡眠效果次之,单体1和3抑制效果较弱。(3)促睡眠肽协同戊巴比妥钠实验探究促睡眠活性本研究采用戊巴比妥钠协同促睡眠物质模型,探索了牛乳促睡眠肽对大鼠睡眠行为的影响以及大鼠血浆和脑部神经递质的变化。结果表明,与正常对照组比较,牛乳促睡眠肽显著缩短大鼠进入睡眠状态的时间,且显著延长大鼠睡眠时间,大鼠入睡时间缩短61.41%,睡眠时间延长254.20%。戊巴比妥钠阈下睡眠剂量实验,表明牛乳促睡眠肽可以增加在30min内大鼠的入睡比率,与正常对照组比,牛乳促睡眠肽组入睡率提高了12.50%。结果表明,在大鼠脑部组织中,在下丘脑中,牛乳促睡眠肽通过降低觉醒物质5-HT水平,提高其代谢产物5-HIAA水平,加快5-HT代谢速率;加速DA的代谢发挥促睡眠功效,而对单胺类神经递质NE无影响,而大鼠脑干和大脑皮层的结果同样显示牛乳促睡眠肽通过调节神经递质水平发挥促睡眠。(4)PCPA致大鼠失眠模型探究牛乳促睡眠肽的作用机制PCPA致大鼠失眠模型是大鼠失眠造模的常用的方法,本研究采用PCPA造模后,给予大鼠牛乳促睡眠肽,研究了观察大鼠的精神状态以及血浆、脑部神经递质的变化。在大鼠血浆中,发现与模型组比较,牛乳促睡眠肽组大鼠血浆中的NE、5-HT、DA有显著性的差异,表明牛乳促睡眠肽可以辅助平衡失眠大鼠血浆中的单胺类神经递质。在下丘脑中,与正常对照组比较,牛乳促睡眠肽主要是通过加快觉醒物质5-HT代谢,5-HIAA/5-HT比值显著增加,DOPAC/DA比值显著增加,加速DA代谢,以及牛乳促睡眠肽显著降低大鼠下丘脑中觉醒物质NE水平来发挥促进睡眠作用。在大脑皮层中,与模型组大鼠比较,牛乳促睡眠肽组大鼠的大脑皮层中5-HT及其代谢产物5-HIAA、DA含量显著性增加,但5-HIAA/5-HT比值无显著性变化,DA的代谢产物DOPAC无显著变化,NE无显著变化,DOPAC/DA比值无影响。在大鼠脑干中,与模型组比较,牛乳促睡眠肽组大鼠脑干中5-HT及其代谢产物5-HIAA、DA及其代谢产物DOPAC含量差异不显著,觉醒物质NE显著降低。(5)促睡眠肽的应用本研究中,牛乳促睡眠肽结合酸枣仁和百合复配成一款促睡眠口服液,该口服液通过大鼠体内活性评价,验证了促睡眠口服液具有较好的促睡眠效果。牛乳促睡眠肽和百合酸枣仁复配后,能显著地缩短大鼠入睡时间,大鼠的入睡时间缩短43.47%。促睡眠产品组能显著延长大鼠睡眠时间,延长率达40.90%。牛乳促睡眠肽可以增加在30min内大鼠的入睡比率,正常对照组组比,牛乳促睡眠产品组入睡率提高12.50%。