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研究背景DEAD/H-box家族的RNA解旋酶是一种具有高度保守序列,依赖ATP活性的解旋酶,其主要功能是参与RNA代谢的各个过程。DEAH-Box 15（DHX15）是该家族成员之一,主要参与RNA剪接、核糖体成熟等RNA代谢过程,是维持细胞内RNA代谢稳定的重要分子。近来研究发现,DHX15和肿瘤发生存在一定相关性。细胞自噬（后简称自噬）是一种高度保守的细胞生理过程,广泛存在于真核细胞内,主要通过其双层膜结构吞噬降解细胞内多余或者有害成分,以维持细胞自身的稳态。这种细胞保护性机制的异常与自身免疫性疾病、糖尿病,尤其肿瘤的发生发展密切相关。自噬和DHX15均参与细胞内稳态的维持,两者是否存在相互关系目前尚未阐明,是否共同参与肿瘤的发生发展也尚不明确。本研究通过探讨DHX15和细胞自噬的关系,明确DHX15在自噬中的作用及机制,同时探索两者对肝癌细胞增殖的影响,以了解DHX15和自噬可能在肝癌发生发展中的作用。研究方法与材料1.利用RNA干扰（RNAi）技术在L02,Huh7,HepG2细胞系中敲减内源性DHX15,利用蛋白质印迹（western blot,WB）方法检测细胞内自噬水平即检测微管相关蛋白1轻链3 beta（LC3B）由I型向II型转换率和SQSTM1（p62）蛋白的变化。2.在稳定表达LC3-GFP的HEK293细胞中敲减内源性DHX15,利用激光共聚焦显微镜观察细胞内LC3荧光斑点即自噬泡的形成情况。3.在L02细胞中敲减内源性DHX15后,利用透射电子显微镜检测自噬泡形成情况。4.利用实时荧光定量聚合酶链式反应（fluorescent real-time quantitative PCR,qPCR）和ATP酶位点突变技术探究DHX15依赖ATP的解旋酶作用在DHX15调控自噬中的作用。5.RNAi敲减HepG2细胞中内源性DHX15,WB方法检测mTORC1的磷酸化蛋白底物水平,验证内源性DHX15调控自噬是否通过mTORC1途径。6.利用细胞活性检测实验（CCK-8 assay）,克隆形成实验以及Ki-67增殖标志实验检测敲减内源性DHX15在HepG2细胞中的促增殖作用,同时利用自噬抑制剂巴弗洛霉素（Bafilomycin A1,Baf-A1）和甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）或者ATG5 si RNA探究自噬在DHX15引起的细胞增殖变化中的作用。研究结果1.细胞内敲减内源性DHX15显著促进自噬的发生,引起LC3-II的显著增加和p62的显著下降,敲减DHX15显著促进自噬小体的形成。2.QPCR实验证明细胞内敲减内源性DHX15和过表达ATP功能域突变的DHX15突变体都不影响自噬相关基因m RNA的表达水平,表明DHX15调控自噬不通过影响自噬基因转录组水平改变,也不依赖DHX15的RNA解旋酶活性。3.DHX15的表达下降显著引起mTORC1通路中的磷酸化蛋白显著减少,表明敲减DHX15通过抑制mTORC1从而促进自噬;4.细胞活力检测试验（CCK-8 assay）,克隆形成实验以及Ki-67增殖标志实自噬抑制剂或者使自噬功能缺陷（即RNAi技术敲减ATG5）能显著逆转其导致的促细胞增殖作用(P***<0.001)。研究结论DHX15是一种新型调控自噬的抑制蛋白,同时具有抑制肝癌细胞增殖的作用;DHX15抑制肝癌细胞的增殖作用依赖于其对自噬的调控作用。