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聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates简写为PHAs)是原核微生物,包括极端嗜盐古菌,在营养不平衡的情况下,作为碳源和能源储备物而合成的高聚物。极端嗜盐古菌Haloferaxmediterranei能够利用非相关碳源合成聚羟基丁酸羟基戊酸酯(PHBV)。该菌的PHA合酶已经由本实验室鉴定与研究,但是为PHBV合成提供前体的相关基因尚不清楚。本论文根据最新测定的H.mediterranei的全基因组序列信息,通过遗传学实验,对PHBV前体合成关键基因进行了鉴定与研究,并揭示了PHBV前体合成的关键步骤。
首先,对已测序的H.mediterranei的基因组进行了全面的分析,并将细菌和其他古菌中已鉴定的与PHA合成相关的酶与H.mediterranei预测的全蛋白质组进行同源性比对,得到相似性比较高的6个基因,分别命名为:phaA1,phaB1,phaB2,phaJ1,phaJ2和phaJ3。
其次,利用RT-PCR检测了6个基因在产PHA的条件下的转录情况。RT-PCR结果表明:在积累PHA的情况下,6个待敲除的基因均有不同程度的转录。因此推测,这6个基因可能在PHA合成途径中起作用。为了进一步验证,将这6个基因逐个进行敲除。单独敲除phaB1,phaJ1,phaJ2和phaJ3对PHA的积累没有明显影响。而敲除phaA1后,得到的突变株△phaA1积累的PHA种类不再是PHBV,而是聚羟基丁酰酯(PHB)。敲除phaB2后的突变株ΔphaB2所积累的PHBV总量明显下降,PHBV所占干重的比例由野生型的28.95％下降至8.94％,而且3-HV单体组分摩尔百分比也有明显的下降,由野生型的9.28mol％下降至2.93mol％。这些结果表明,phaA1基因可能编码一种β-酮硫解酶(PhaA),特异催化一分子乙酰-CoA和丙酰-CoA生成一分子3-酮戊酰-CoA,为合成PHBV提供3-HV组分。基因phaB2可能编码乙酰乙酰-CoA还原酶,催化还原乙酰乙酰-CoA和3-酮戊酰-CoA,分别生成3-HB-CoA和3-HV-CoA。菌株ΔphaB2中还能合成少量的PHA,因此说明H.mediterranei中除了phaB2,还有别的phaB基因编码乙酰乙酰-CoA还原酶,其它的phaB基因还需进一步鉴定。
随后,在突变株ΔphaB2中继续敲除基因phaB1,得到突变株ΔphaB1phaB2。在菌株ΔphaJ1中敲除基因phaJ2,得到突变株ΔphaJ1phaJ2。并进一步在菌株ΔphaJ1phaJ2中敲除基因phaJ3,得到突变株ΔphaJ1phaJ2phaJ3。在突变株ΔphaB1phaB2中已经检测不到PHBV的存在。而无论是ΔphaJ1phaJ2还是ΔphaJ1phaJ2phaJ3产生PHBV的总量和3-HV组分摩尔百分比与野生型相比,都无明显变化。表明:编码乙酰乙酰-CoA还原酶的两个关键基因为phaB1和phaB2。基因phaB1在phaB2存在的情况下不发挥作用,在phaB2被敲除之后,phaB1才代替phaB2,行使相应的功能。
最后,在突变株ΔphaA1中互补phaA1基因后,积累PHBV的能力得到恢复。在突变株ΔphaB1phaB2中分别互补phaB1和phaB2基因,得到重组菌:ΔphaB1phaB2/B1和ΔphaB1phaB2/B2,ΔphaB1phaB2/B2所产的PHA已经恢复到野生型的水平,而ΔphaB1phaB2/B1所产的PHA与突变株ΔphaB2的情况相似。将重组质粒pWLA1(自身启动子)导入Haloarculahispanica,使phaA1基因在H.hispanica中异源表达,得到的重组菌所产的PHBV中3-HV单体组分摩尔百分比大幅度提高,由野生型的3.61mol％上升至9.70mol％。但奇怪的是,将重组质粒pWLA1(自身启动子)导入宿主菌H.mediterranei后,对PHBV的积累没有明显影响。
本论文的研究工作表明,在H.mediterranei中,可能主要存在由乙酰-CoA和丙酰-CoA提供前体的途径,并由PhaA及PhaB蛋白催化。