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肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种多功能细胞因子，因其能在体内、外特异杀伤肿瘤组织细胞而被认为是一种有潜力的抗癌药物。然而它的毒副作用大大限制了它在临床中的应用。随着肿瘤学和分子生物学技术的飞速发展，应用基因工程技术将人肿瘤坏死因子-α(Human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)的结构进行改造，以达到降低毒副作用、增强抗肿瘤活性并赋予肿瘤靶向性等效果，这在恶性肿瘤的治疗方面呈现出良好的应用前景。
目的：
1.应用基因工程技术，对hTNF-α进行结构改造，以期获得同时解决hTNF-α毒副作用和肿瘤靶向性问题的rhTNF-α。
2.利用本课题组先前构建好的两种由明胶酶介导的肿瘤靶向性rhTNF-α融合蛋白的pET32a(+)原核表达质粒：带有胶原蛋白(Collagen)序列、明胶酶(MMP-2和MMP-9)底物序列和hTNF-α突变体基因，优化融合基因在大肠杆菌Rosseta2 (DE3)体系的表达条件，实现高效表达。
3.确立rhTNF-α融合基因表达产物的纯化方案，获得两种rhTNF-α融合蛋白的纯化产物。
方法：
1.重组质粒pET-32a(+)-Collagen-MMP2,9a-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP2,9b-hTNF的筛选及鉴定1)SDS碱裂解法小量提取质粒；
2)CaCl2法制备Rosseta2 (DE3)感受态细胞；
3)将rhTNF-α表达质粒转化入Rosseta2 (DE3)感受态细菌中；
4)测序鉴定。
2.融合蛋白的诱导表达及提取1)IPTG诱导阳性重组细菌表达融合蛋白；
2)按Novagen公司BugBuster His·Bind Purification Kits试剂盒方法进行融合蛋白的提取；
3)SDS-PAGE分析。
3.目的蛋白表达条件的优化1)融合蛋白的表达时间分析；
2)融合蛋白的诱导浓度分析；
3)融合蛋白的诱导温度分析。
4.融合蛋白的纯化按Novagen公司BugBuster His·Bind Purification Kits试剂盒方法进行融合蛋白的纯化，SDS-PAGE分析鉴定。
5.肠激酶切除载体标签
6.凝胶过滤层析进一步分离纯化蛋白
7.人肿瘤坏死因子定量ELISA测定结果：
1.确立了重组pET-32a(+)-collagen-MMP2-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP9-hTNF质粒在大肠杆菌Rosseta2(DE3)的表达条件，获得了两种rhTNF-α融合基因的高比例可溶性表达产物。
2.确立了融合基因表达产物的提取和初步纯化方案，获得两种rhTNF-α融合蛋白的初步纯化产物。
3.成功解决了蛋白沉淀问题，使后续实验能够顺利进行。
4.成功切除了融合蛋白上的载体标签。
5.确立了凝胶过滤层析分离蛋白的纯化方案。
6.用ELISA法初步确定了融合蛋白中含有rhTNF-α。
7.由于时间的限制未能进一步进行蛋白纯化条件的优化，获得大量高纯度的有活性的目的蛋白。因此，尚无法确定所得到的蛋白是否有抗肿瘤活性及其导向性的效果。
结论：
本实验利用基因工程技术，确定两种由明胶酶介导的肿瘤靶向性rhTNF-α融合蛋白在大肠杆菌系统表达的条件和表达产物的提取纯化方案，特别是解决了融合蛋白纯化过程中的沉淀问题，并获得了纯化产品(电泳纯)。为下一步获得大量的有活性的rhTNF-α融合蛋白解决了技术问题，也为今后进一步进行体外、体内肿瘤靶向性评估和抗肿瘤活性分析奠定了基础。