RAB4B参与过氧化氢诱导的细胞DNA损伤机制的初步研究

• 作 者: 余辉
• 机 构: 广东医科大学
• 出 处: 广东医科大学
• 发表日期: 2019年4期
• 关键词: RAB4B基因

【目的】
　　前期预实验发现：在对照组和人工诱导DNA损伤组中，RAB4B存在显著差异性表达。基于预实验结果及国内外有关文献报道，进一步探讨RAB4B基因功能：如DNA修复、细胞周期调节和细胞氧化应激机制，为全面解析RAB4B基因功能和人类衰老相关疾病提供线索。
　　【方法】
　　1.利用分子克隆技术构建过表达RAB4B基因的重组质粒,并将重组质粒转染到人肾胚细胞HEK293T。
　　2.设计RAB4B基因的siRNA干扰片段，并将干扰片段转染到人肾胚细胞HEK293T。
　　3.利用蛋白免疫印迹技术(Westernblot,WB)检测DNA损伤分子标记物γH2AX及其他信号蛋白的表达。
　　4.利用细胞免疫荧光法观察过表达和干扰RAB4B基因细胞的损伤灶点情况。
　　5.利用CCK8法检测过表达和干扰RAB4B基因细胞生长活性变化。
　　6.利用EdU细胞增殖检测试剂盒检测过表达和干扰RAB4B基因细胞增殖。
　　7.利用流式细胞术检测过表达和干扰RAB4B基因细胞内的活性氧含量及细胞周期的变化。
　　【结果】
　　1.RAB4B在H2O2诱导的DNA损伤细胞中显著下调
　　与对照组相比，800μmol/LH2O2处理实验组在H2O2诱导细胞DNA损伤后，Westernblot检测发现γH2AX表达量明显上调；RAB4B表达量呈现剂量依赖性下调。（差异倍数＞2.0，P＜0.05）。
　　2.RAB4B的过表达和缺失对细胞表型的影响
　　干扰RAB4B表达后，用CCK8检测细胞活性，结果显示，与对照组相比，细胞活力显著降低（差异倍数＞2.0，P＜0.01）；EdU增殖实验显示，沉默RAB4B的可显著降低细胞增殖能力。沉默RAB4B后流式细胞术检测周期，结果显示,G1期细胞显著增多，S期和G2/M期细胞相对减少。
　　3.RAB4B对细胞氧化损伤的分子机制影响
　　蛋白免疫印迹技术结果显示，在HEK293T细胞中干扰RAB4B的表达，γH2AX表达升高，参与DNA损伤修复的调控蛋白：毛细血管共济失调突变基因蛋白(ataxiatelangiectasiamutatedgene,ATM)和DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependentproteinkinase,DNA-PKcs)表达量也明显上调。
　　【结论】
　　实验表明：RAB4B通过影响ATM/DNA-PKcs的表达参与细胞氧化损伤条件下的DNA损伤修复，通过ATM/p53途径对过氧化氢诱导的人肾胚细胞HEK293T氧化损伤起加强毒性作用。同时，沉默RAB4B基因，p21表达增加，抑制CDK2表达，使细胞停滞于G1期。