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Ⅱ型猪圆环病毒(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原,同时与猪群中许多传染病密切相关,严重威胁养猪业的健康发展。PCV2的致病机制目前仍不十分清楚,这与尚未有效筛选出与PCV2病原性相关的遗传致病因子有很大的关系。PCV2基因组全长1767～1768 bp,含有11个潜在的开放阅读框(ORFs)。目前,已知功能的阅读框有3个,ORF1编码2个与病毒复制相关蛋白(Rep和Rep),ORF2编码结构蛋白(Cap),ORF3编码蛋白可诱导细胞凋亡,其它阅读框是否编码蛋白以及编码蛋白有何功能仍不清楚,本研究拟在通过对PCV2 ORF3基因mRNA表达分析的基础上,尝试运用荧光定量RT-PCR技术以及cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术对ORF4基因mRNA进行转录检测分析,为进一步从蛋白水平研究检测ORF4基因表达奠定基础,并最终为ORF4基因功能的研究提供新的研究方法和理论依据。
首先,设计一对PCV2全长特异扩增引物,引入便于后期基因操作的XbaⅠ酶切位点,以分离自临床病料组织的细胞培养适应毒株(PCV2-SY)为模板,构建了PCV2全长分子克隆,对其基因组序列及主要的阅读框ORF1、ORF2、ORF3和ORF4进行了序列同源性比对和遗传背景分析。其次,以测序的PCV2-SY毒株序列为参考,设计可特异扩增ORF3基因以及同时扩增ORF3和ORF4(ORF3+4)基因的引物,并以构建的PCV2全长分子克隆为标准品,构建可定量检测ORF3基因以及ORF3+4基因转录产物的荧光定量RT-PCR体系;对体外培养PK-15细胞接毒后不同间隔时间内病毒ORF3基因以及ORF3+4基因mRNA的转录表达情况进行了定量分析,并在此基础上对ORF4基因的转录表达进行了定性分析。最后,通过3RACE技术对ORF4基因mRNA3末端poly(A)位点进行了鉴定。结果如下:(1)PCV2-SY毒株基因组序列全长1767 bp,为PCV2b亚型;与GenBank已发表的PCV2毒株间的序列同源性介于95.4％～99.9％之间,并与中国江苏安徽等地的分离株亲缘关系最近;ORF4基因核苷酸及其推导氨基酸序列同源性分别为98.3％～100.0％和95.0％～98.3％,不存在明显的变异。(2)成功构建可准确定量比较OR-F3和ORF3+4基因mRNA表达差异的荧光定量RT-PCR体系,定量范围为8×106～8×101拷贝数之间(R2＞0.99)。(3)在体外PCV2感染细胞中,不同时期ORF3+4基因mRNA拷贝数均显著高于ORF3基因(P＜0.05),间接说明ORF4基因转录水平表达的存在,同时ORF3、ORF4基因mRNA可能存在不同的转录起点。(4)通过3RACE技术分别检测到与ORF3和ORF4基因mRNA相关的poly(A)加尾位点。其中,ORF3基因mRNA相关poly(A)加尾位点位于编码序列终止密码子下游基因组第246碱基处;而ORF4基因mRNA相关poly(A)加尾位点位于基因组第1008碱基处,且在361:800处存在一反式剪接位点。
结合荧光定量RT-PCR技术以及3RACE技术从转录水平证实在体外PCV2感染细胞中存在ORF4基因的mRNA转录,并且其通过选择性反式剪接与rep基因mRNA共享3非编码区序列。