白灵菇中小分子功效成分的分离纯化及其生物活性研究

• 作 者: 郝静凤
• 出 处: 天津大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 白灵菇 功效成分 分离纯化 抑制肿瘤 作用机制

白灵菇是一种含有丰富营养成分和活性成分的大型食用药用真菌,目前对它的研究多集中在栽培技术的优化和活性多糖的分析。本课题以白灵菇子实体为研究对象,围绕其小分子功效成分的分离纯化、生物活性以及作用机制进行探索。为白灵菇资源深入开发和充分利用提供科学依据和理论基础。按照有机溶剂极性的大小将白灵菇甲醇提取物依次进行萃取,分别得到正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。体外化学模拟法的结果显示白灵菇乙酸乙酯萃取物对DPPH、ABTS、O^2-和OH四种自由基都具有较强的清除效果,并呈现剂量效应关系。采用硅胶柱色谱等多种技术结合显色反应从白灵菇乙酸乙酯萃取物中首次分离获得9种化合物单体,通过核磁共振以及质谱技术鉴定1-9分别为:麦角甾醇、尿嘧啶、麦角甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、啤酒甾醇、脑苷酯B、5’-甲基硫代腺苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、次黄嘌呤。MTT法的结果表明麦角甾醇、麦角甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、啤酒甾醇和脑苷酯B能不同程度地抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,抑制能力依次是:麦角甾醇﹥脑苷酯B﹥麦角甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷﹥啤酒甾醇,其中250μM的麦角甾醇处理72 h后细胞的生存率仅为21.01%,而化合物2和6-9对MCF-7细胞基本无抑制活性。Hoechst 33342染色法观察到,细胞的荧光强度随麦角甾醇浓度的增加而增强,甚至出现凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳结果表明不同浓度的麦角甾醇处理组均出现DNA梯度条带,提示DNA发生有序降解,诱导肿瘤细胞发生凋亡;流式细胞术分析表明,细胞MCF-7的凋亡率随麦角甾醇的处理由0.02%显著上升到53.88%,同时G0/G1期的细胞所占比例由98.23%降低为73.85%,而S期的细胞比例由1.76%显著升高到24.39%,说明细胞阻滞发生在S期。实时荧光定量PCR进一步显示麦角甾醇引起促凋亡基因Bax表达的增多、抗凋亡基因Bcl-2表达的降低,增加了cyt C的释放,从而激活了caspase-9和caspase-3,引发caspase家族的级联反应,诱导细胞发生凋亡。综上所述,麦角甾醇可能是通过阻滞细胞周期以及通过线粒体途径诱导细胞凋亡发挥抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖作用。