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前言：
目前减轻急性心肌梗死缺血性损伤的有效手段是尽早实施再灌注治疗,而再灌注同时会增加心肌损伤,包括微血管损伤、心律失常以及心肌细胞坏死的扩展。但关于心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤确切的细胞机制仍未被完全清晰地阐明,心肌血流的中断和再恢复将触发许多病理生理过程,其中作为多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)家族中最丰富的同工酶PARP-1的过度活化可能成为研究的关键,它或许是动物模型再灌注过程中介导氧化诱导的细胞功能障碍和死亡的一个关键途径。
已知PARP-1涉及坏死性细胞死亡,这种死亡与细胞凋亡和自噬相比较,代表了一种更严重的细胞终结形式。广泛的DNA损伤(活性氧如过氧亚硝酸盐,羟基和超氧自由基)导致PARP过度活化从而消耗细胞内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotin amideadenine dinucleotide,NAD+)储备,降低NAD+水平并通过氧化磷酸化抑制三磷酸腺苷(adenosine triphos phate,ATP)的产生,导致坏死性细胞死亡。PARP过度活化所致的细胞坏死性死亡与缺血再灌注损伤中由PARP-1抑制或缺失所提供的显著的细胞保护作用相一致,而缺血再灌注损伤主要以坏死性细胞死亡为特征。因此,坏死是一种普遍的死亡方式并且也能被调控,研究证实PARP-1在与坏死和炎症相关的缺血再灌注损伤中起到至关重要的作用,因此,PARP抑制剂可使此类疾病明显获益,目前少数PARP抑制剂已进入临床试验阶段。最新研究显示,自由基-介导的PARP活化作用并不仅限于心肌,循环白细胞同心肌细胞一样在再灌注后同样存在着PARP过度活化。
在此背景下,本研究旨在探讨循环白细胞内PARP激活能否作为再灌注心肌中PARP活化的一个监测指标。为此,我们应用大鼠首先测定PARP活化的终产物多聚ADP-核糖(poly(ADP-ribose),PAR)的含量,以明确心肌缺血再灌注损伤进程中循环白细胞和再灌注心肌中PARP活化情况。其次,我们进一步明确循环白细胞内PARP活化程度与心肌梗死范围的关系。最后,我们探讨PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)对PARP活性的作用及其在心肌缺血的在体模型中提供心肌保护的治疗时间窗。
目的：
建立大鼠心脏I/R模型,检测再灌注早期不同时点心肌和外周血白细胞内PARP-1活化产物PAR的表达;同时测定心肌梗死范围,探讨外周血白细胞PARP-1活化与心肌PARP-1活化间的关系,及其与心肌损伤间的关系。最后,探讨PARP抑制剂3-AB对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其有效给药时间。
方法：
1、大鼠心脏I/R损伤模型的建立和分组
采用开胸结扎和松开冠状动脉的方法建立大鼠心脏I/R损伤模型。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,气管切开插管行小动物呼吸机辅助呼吸,呼吸频率75次/min。在第四肋间行左胸廓切开术,暴露心脏,打开心包,挤出大部分心脏。暴露肺动脉圆锥与左心耳根部间的左冠状静脉。以左冠状静脉为标志,用5-0缝线在左冠状静脉下穿线,连同左冠状静脉一起在距冠状动脉前降支根部1-2mm形成一个直径约5mm的活结,将5mm聚乙烯软管置于活结中。45min后拔出聚乙烯软管,使冠状动脉血流再通,在整个缺血和再灌注过程中,一直监测大鼠肛温,通过热挚和台灯维持大鼠体温在37-38℃。
(1)缺血再灌注不同时点PAR在心肌以及外周血白细胞内表达,随机分为:sham组;I/R0min组;FR15min组;I/R2h组;I/R6h组;I/R24h组
另设一组,通过轻微改变冠脉结扎位置来获得一个较广泛的心肌梗死范围进一步明确缺血再灌注不同时点外周血白细胞PARP-1活化与心肌损伤间的关系,随机分为:I/R2h组;I/R6h组;I/R24h组
(2)为明确PARP抑制剂3-AB对大鼠心肌缺血再灌注2h后心肌梗死范围以及PARP活化的影响,随机分组为假手术+生理盐水组、假手术+3-AB组、I/R2h+生理盐水组、I/R2h+3-AB组,3-AB(20mg/kg,每2小时,于再灌注前15分钟iv.给药)。
为明确PARP抑制剂3-AB对大鼠心肌缺血再灌注24小时的心肌保护作用及其有效给药时间,另设一组为I/R24h+生理盐水组、I/R24h+3-AB组,3-AB(20mg/kg,分别于再灌注前15分钟、再灌注后15分钟、2小时、4小时iV.给药)。
2、外周血白细胞的准备
抽取肝素化抗凝全血6ml,应用单个核细胞分离液,采用密度梯度离心方法分离单个核细胞。将6mlHistopaque-1083置于离心管底部,轻移6ml抗凝全血至其顶部,室温下以800g离心15分钟,后用吸管抽吸血浆层至0.5cm厚包含单个核细胞的不透明层,收集分离的单个核细胞使用梯度降温法于-70℃冰箱中保存备用。
3、心肌缺血危险区、梗死范围检测
采用伊文氏兰-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色检测各组缺血危险区(areaatrisk,AAR)及心肌梗死面积(infarctsize,IS)。再灌注结束时,再次原位结扎冠状动脉,从左心室腔注入2%伊文氏兰3ml,未缺血心肌组织染成蓝色,缺血心肌不染色,即为缺血危险区。剪去右心室和心房,冻存后切厚度为2mm的横断面切片4-5个,缺血左室部分置于37℃下1%的TTC溶液中孵育20分钟,染色后将心脏切片以10%甲醛溶液固定6h。三种颜色(白,红和蓝)分别代表梗死区、非梗死的缺血区和非缺血区,非梗死的缺血区和梗死区一起作为缺血危险区。缺血危险区用缺血危险区心肌重量与左室重量之比(AAR/LV%)表示,而梗死区范围用梗死区心肌重量与缺血危险区心肌重量之比(IS/AAR%)表示。
4、WresternBlot以及免疫组织化学方法检测各组心肌和外周血白细胞的PARP活化产物PAR表达。
采用WesternBlot方法检测各组心肌和外周血白细胞的PAR表达。取组织或细胞匀浆液离心后应用Bradford进行蛋白含量检测。取蛋白20μL(50μg)上样于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶上,电泳电压120V,转膜后封闭,按照1:400稀释PAR,1:2000稀释β-actin抗体37℃孵育1小时,放入4℃冰箱过夜进行一抗杂交,取相对应二抗杂交,电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)发光,将胶片于成像系统中拍照,以QuantityOne4.6.2成像软件分析电泳带的灰度值,以PAR目的片段(116kd)的灰度值与相应的β-actin的灰度值的比值为各个样本PAR表达量的比例。
采用免疫组化方法检测各组缺血心肌PAR表达。心肌标本用4%多聚甲醛固定,连续切片4μm厚,滴加1:100稀释小鼠PAR单克隆抗体,4℃孵育过夜,加生物素标记的马抗小鼠二抗,37℃孵育20min,加亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(avidin-biotin-peroxidasecomplex,ABC)-辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase.HRP)37℃孵育后,二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidineDAB)显色,苏木素复染。
结果：
1、大鼠心肌缺血45分钟再灌注不同时点导致心肌不同程度的损伤。
2、大鼠心肌缺血45分钟后,不同时点(0min、15min、2h、6h、24h)的再灌注心肌以及外周血白细胞内存在不同程度PARP-1活化产物PAR的表达。缺血45分钟再灌注0min,心肌PARP-1无明显活化,而再灌注后15min心肌PARP-1活性即刻显著增高,再灌注2h-6h达峰值,并持续活化至再灌注24h。PAR染色主要位于缺血心肌细胞、血管内皮细胞以及浸润的单核细胞核内。同时点检测出外周血白细胞内PARP-1活化变化同心肌改变相似。
3、再灌注早期不同时点外周血白细胞和心肌PARP-1活化产物PAR的表达具有相关性(r2=0.692,P＜0.001)。
4、再灌注6h外周血白细胞PARP.1活化产物PAR的表达与心肌梗死大小具有相关性(r2=0.836,P＜0.001),而再灌注2h(r2=0.341,P=0.076)和24h(r2=0.119,P=0.33)未发现二者存在相关性。
5、PARP抑制剂3-AB显著减少大鼠再灌注2h心肌梗死范围(57.6±2.7%vs.40.9±2.3%,P＜0.001)。
6、PARP抑制剂3-AB有效抑制再灌注2h大鼠外周血白细胞及心肌PARP活化。假手术组大鼠心肌中只有微弱的PAR表达。I/R组大鼠外周血白细胞及心肌中的PAR表达明显增加(P＜0.001),应用3-AB后,PAR表达降低,与I/R组相比P＜0.05。
7、PARP-1抑制剂3-AB有效治疗时间窗:再灌注前15分钟(49.3±1.7%vs.67.3±1.8%,P＜0.001)和延迟给药再灌注后15分钟(52.2±2.1%vs.66.5±2.6%,P=0.001)、2小时(56.6±1.7%vs.67.1±2.2%,P＜0.05)均具有保护作用,而延迟给药至再灌注后4小时未能减小梗死范围(59.1±2.3%vs.66.2±2.7%.)。
结论：
再灌注早期循环白细胞PAR表达与心肌PAR表达存在正相关,再灌注6h外周血白细胞PARP-1活化产物PAR的表达与心肌梗死大小具有相关性,循环白细胞的PARP-1活化可能作为临床监测再灌注损伤的特异性标志物。PARP-1抑制剂3-AB能降低心肌缺血再灌注损伤后的心肌梗死范围,其心肌保护作用涉及对循环和心肌PARP-1活性的抑制。PARP-1抑制剂3-AB有效治疗时间窗:再灌注前和再灌注后2小时延迟给药均具有心肌保护作用。