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艾滋病是由人类免疫缺陷病病毒(HIV)感染引起的一种严重威胁人类健康的疾病。HIV快速检测对病情控制、药物疗效以及血液筛查等也十分重要。传统的检测方法存在试剂消耗量大、分析时间长、操作过程繁琐、灵敏度不高等缺点。采用芯片实验室检测HIV可能解决以上问题。但是传统检测技术不能直接移植到芯片实验室中使用,因此,有必要建立一种适用于芯片实验室的检测技术。
纳米金磁颗粒是包被有纳米金外壳的纳米级磁性复合微粒,具有超顺磁性、悬浮稳定性等特点可以很好地解决生物大分子在芯片实验室微通道中的操纵。同时纳米金微粒具有大的比表面积,标记方法简单、效率高。本研究利用纳米金磁微粒作为一种新的生物分子标记技术,结合核酸等温扩增技术建立新型的HIVp24免疫检测平台,完成了以下研究内容：
第一、以纳米金磁包被p24第一抗体,制备了纳米金磁探针,其包被率达86.47％；采用纳米金磁作为包被载体,使整个反应在均相溶液中进行,比传统的固相反应具有更高的反应效率。
第二、以纳米金标记p24第二抗体和报告DNA分子,制备了纳米金探针,其抗体标记率达87.12％,报告DNA标记率达34.05％。以纳米金作为抗体和报告DNA的连接物,将检测p24的免疫信号转化为报告DNA的核酸信号。通过定量分析表明,一个纳米金颗粒可以结合几个抗体分子和几十个报告DNA分子。
第三、建立了针对报告DNA检测的TMA等温扩增技术,且初步实现了实时检测。与传统的PCR相比,采用TMA等温扩增技术检测核酸信号具有与PCR同等的扩增效率,但在恒温条件下扩增,不需要复杂的变温系统,由此简化了芯片实验室的设计。
第四、克隆并纯化了TMA的工具酶-MMLV-RT,酶纯度达96％,且具有商业RT酶的同等活力。
第五、建立了基于纳米标记技术和等温扩增技术的新型HIV p24检测平台,其检测灵敏度达0.1fg/mL。
该检测技术与芯片实验室相结合,可以建立低成本、高灵敏度、便捷的免疫检测平台,除了HIV检测外,还可以用于其他病原微生物的检测,在临床诊断、环境监测和食品卫生等方面将有重要应用前景。