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目的： 首先，观察硫化氢供体的表面体征及吸收光谱，检测硫化氢供体对急性分离海马神经元和人喉癌上皮细胞系Hep-2细胞活性的影响以及光学成像作用；其次，在细胞水平，原代培养海马神经元并鉴定，硫化氢供体与海马神经元共培养，无镁细胞外液处理建立癫痫细胞模型，观察硫化氢供体对海马神经元的细胞活性的影响，检测海马神经元Kir6.2、SUR1mRNA的表达，深入探讨细胞内硫化氢供体对海马神经元的保护作用及机制；最后，在动物水平，建立动物癫痫模型，侧脑室注射硫化氢供体，观察行为学表现、记录脑电，免疫组化检测Kir6.2在海马及皮层中的表达，检测皮层及海马组织中Kir6.2、SUR1蛋白和mRNA的表达，深入探讨硫化氢供体对癫痫的抑制作用及机制。 方法： 第一部分：透射电镜下观察硫化氢供体的表征情况，进行硫化氢供体吸收光谱的测定，用CCK-8试剂盒检测硫化氢供体对原代海马神经元和人喉癌上皮细胞系Hep-2的细胞活性的影响，并筛选出硫化氢供体作用的最大安全浓度和作用时间，用激光共聚焦检测硫化氢供体在两种细胞内的吸收以及发光通道情况。 第二部分：在细胞水平上，进一步探索硫化氢供体对海马神经元的作用及机制，原代培养新生SD大鼠海马神经元，NSE/DAPI双染法进行鉴定，无镁细胞外液处理3h建立癫痫细胞模型。我们将海马神经元分为5组：①对照组（Control），正常细胞外液处理3h；②癫痫细胞模型组（EPI），用无镁细胞外液处理3h；③硫化氢供体干预组（H2S Donor+EPI），用配有400μM硫化氢供体的培养基培养12h，用无镁细胞外液处理3h；④硫化氢供体空白对照组（H2S Donor），用配有400μM硫化氢供体的培养基培养，用正常细胞外液处理3h；⑤羟胺对照组（HA+EPI），用配有100mM羟胺的培养基培养12h，用无镁细胞外液处理3h。用RT-qPCR法检测各组海马神经元Kir6.2、SUR1mRNA的表达。 第三部分：在动物水平上，进一步探索硫化氢供体对癫痫的作用及机制，我们将大鼠随机分为5组：①对照组（Control），侧脑室注射生理盐水，腹腔注射生理盐水；②癫痫持续状态组（SE），侧脑室注射生理盐水，腹腔注射戊四氮；③硫化氢供体干预组（H2S Donor+SE），侧脑室注射500μM硫化氢供体，再腹腔注射戊四氮；④硫化氢供体空白对照组（H2S Donor），侧脑室注射500μM硫化氢供体，腹腔注射生理盐水；⑤羟胺对照组（HA+SE），侧脑室注射生理盐水，腹腔注射羟胺12.5mg/kg，30mins后再腹腔注射戊四氮。观察造模后各组大鼠行为学表现，记录大鼠首次诱发癫痫样放电潜伏期时间及持续时间，并使用BL-420生物信号系统记录各组大鼠脑电图的变化；通过免疫组化的方法检测各组海马及皮层中Kir6.2的定位和表达，用Western blot和RT-qPCR法检测皮层和海马组织中Kir6.2、SUR1蛋白和mRNA的表达。 结果： 第一部分结果： 1、扫描电镜：扫描电镜观察硫化氢供体的表征形貌，硫化氢供体的微观形态呈现出由许多微管组成的均匀微团，这些管表现出高度的结晶度和规律性。 2、吸收光谱：吸收光谱的特征峰，硫化氢供体在230nm处至310nm处对光有强吸收，作为参考在吸收峰附近选择激发硫化氢供体的荧光波长。 3、CCK-8结果:根据实验结果，我们选择最佳浓度为400μM，优化时间为12h以检测体外光学成像。 4、激光共聚焦结果：共聚焦观察与硫化氢供体共培养12小时后海马神经元和Hep-2的荧光发光情况。硫化氢供体在细胞摄取后仍具有高荧光发射性质。 第二部分结果： 1、NSE/DAPI双染法：经NSE抗体染色后进一步证实培养的细胞主要为神经元，占总细胞的90%左右。 2、CCK-8法：无镁细胞外液处理3h后，EPI组、H2S Donor+EPI组、HA+EPI组相比Control组细胞活性下降；与EPI组相比，H2S Donor+EPI组、H2S Donor组细胞活性增高。 3、RT-qPCR检测海马神经元Kir6.1、SUR2mRNA的表达：无镁细胞外液处理3h后，EPI组、HA+EPI组与Control组相比大鼠海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达均降低；H2S Donor+EPI组、H2S Donor组海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达与SE相比表达增高。 第三部分结果： 1、行为学：Control、H2S Donor组的大鼠行为学表现正常，无发作。而SE组的大鼠出现癫痫发作，表现为Ⅳ~Ⅴ级；H2S Donor+SE组的大鼠癫痫潜伏期明显延长，发作的级别也降低，表现为Ⅰ级或Ⅱ级，与SE组相比较，潜伏期延长，发作持续时间也缩短。 2、脑电图：Control、H2S Donor组并没有出现棘波或棘-慢综合波，为正常的脑电图波形。SE组、HA+SE可以记录到明显的尖波、棘波或棘-慢综合波，波幅较大，波幅大小与对照组比较有显著差异；H2S Donor+SE组观察到偶尔会出现尖波、棘波或棘-慢综合波，波幅减小，与SE组相比较有差异；硫化氢供体空白组的大鼠海马脑电波的波幅与Control相比较差异没有统计学意义。 3、免疫组化：Kir6.2主要定位于皮层、海马齿状回、CA3区。皮层、齿状回、CA3区中Control组虽然可见阳性物质，但颗粒染色浅，分布稀疏；SE、HA+SE组观察到免疫反应逐渐减弱，阳性细胞数量减少，与Control组平均光密度值降低；H2S Donor+SE组和H2S Donor组中Kir6.2免疫反应逐步增强，阳性着色细胞数量，与SE组相比平均光密度值增高。 4、RT-qPCR检测皮层及海马中Kir6.1、SUR2mRNA的表达：SE模型后皮层中，SE组、HA+SE组与Control组相比大鼠海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达均降低；H2S Donor+SE组、H2S Donor组海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达与SE相比表达增高，差异有统计学意义。SE模型后海马中，SE组、HA+SE组与Control组相比大鼠海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达均降低；H2S Donor+SE组、H2S Donor组海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达与SE相比表达增高，差异有统计学意义。 5、Western blot检测皮层及海马中Kir6.2、SUR1蛋白的表达：SE模型后皮层中，SE组和HA+SE组大鼠皮层组织中Kir6.2、SUR1蛋白含量显著低于Control，H2S Donor+SE组和H2S Donor组Kir6.2、SUR1蛋白含量，相比SE组差异显著。SE模型后海马中，SE组、HA+SE组与Control组相比大鼠海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达均降低；H2S Donor+SE组、H2S Donor组海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达与SE相比表达增高。 结论： 1、硫化氢供体具有良好的安全性和细胞成像能力。 2、硫化氢供体对原代海马神经元有保护作用；其保护作用可能与上调Kir6.2、SUR1的表达有关。 3、硫化氢供体可抑制大鼠癫痫发作；其抑制作用可能与上调Kir6.2、SUR1的表达有关。