秋石斛原球茎再生体系建立和遗传转化的初步研究

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秋石斛(Dendrobiumphalaenopsis)又名蝶花型石斛,是石斛兰中最具观赏价值的种群,因其具有开花时间长、花姿优雅、花多、枝长等特点,在兰花 目前秋石斛的种苗大多来自外国。或台湾省,且品种单调,数量少。秋石斛的优良单株靠常规分株繁殖方法远远不能满足市场的需要,并且容易由于病毒的积累等原因导致观赏品质的降低。因此利用离体培养技术进行工厂化育苗,是秋石斛生产必不可少的环节。同’时,建立秋石斛的高效再生体系也为进一步的体细胞突变筛选和转基因育种打下基础。 农杆菌介导的基因转化在秋石斛上的研究报道不多,因此,研究秋石斛遗传转化过程中各种因素的影响十分必要。 本研究是以长期培养的秋石斛原球茎为实验材料,研究了不同植物生长调节剂配比、蔗糖浓度及有机添加物对秋石斛原球茎的增殖、芽分化和根的诱导的影响,同时对秋石斛液体一固体结合的循环培养的条件进行了探讨,优化了秋石斛原球茎增殖和再生的条件,并在此基础上对农杆菌介导的秋石斛遗传转化的条件进行了初步的研究。结果如下:L长期培养的秋石斛原球茎增殖的适宜培养基为·:MS+BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖2Sg/L+琼脂7g/L(pH=5.8);秋石斛原球茎分化芽的最佳培养基为:MS+BA0.5mg/L+CM10%+蔗糖30g/L+琼脂7g/L(pH=5.8);秋石斛生根的最佳培养基为:1/2MS+IBA2.0mg/L+蔗糖15g/L+CW15%+AC0.1%+琼脂7g/L(pH=5.8)。2.秋石斛原球茎液体悬浮培养的最佳继代周期为20d。液体悬浮培养后的原球茎过渡至固体培养基继续培养时,适宜的培养基为1/2MS+CM10%+蔗糖30g几+琼脂7g/L(pH=5.8)。 3.卡那霉素对秋石斛原球茎的有效筛选浓度是100mg/L。通过不同的筛选方法的比较,确立了采用梯度浓度加入抗生素的方法,减轻抗生素对外植体的伤害。潮霉素在固体培养基中的有效筛选浓度为40mg/L,而在液体培养基中是20mg/L。100mg几的头孢霉素可以有效的抑制侵染后残余农杆菌的生长,而且对外植体的增殖、生长没有很大的抑制作用。 4.用携带植物表达载体pBIl2l的农杆菌GV310l侵染秋石斛原球茎,侵染时间以8h比较适宜,gus瞬时表达率为100%。侵染时,切割原球茎可以提高瞬时表达率,蓝斑面积大于50%的外植体比率最高可达80%。采用发育不成熟原球茎和愈伤组织混合体的薄片进行侵染效果不好,在0~10h的侵染时间内,蓝斑面积大于50%的比率为O。
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