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目的: 构建HBV不同基因型拉米夫定耐药变异类型与野生型全基因真核表达质粒经转染HepG2细胞,体外观察HBV拉米夫定耐药变异对病毒DNA和抗原表达的影响；同时建立可表达HBV C基因型野生株和拉米夫定耐药变异株稳定表达细胞系。为进一步研究HBV拉米夫定耐药变异机制,寻求有效治疗方法奠定实验学基础。
方法：(1)定向克隆技术构建HBV不同基因型拉米夫定耐药变异类型与野生型全基因真核表达质粒。(2)脂质体方法转染HepG2细胞。(3)Real-time PCR方法检测HBV DNA的表达。(4)ELISA方法检测抗原的表达。(5)细胞毒性实验确定G418最佳筛选浓度。(6)稳定转染并筛选建立稳定表达细胞株。(7)MTT实验检测拉米夫定对HepG2细胞毒性。(8)FH-PCR-MC方法检测细胞株YMDD变异类型。
结果：(1)构建HBV不同基因型野生株和拉米夫定耐药变异株重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV 14株。(2)与对应基因型野生株序列比对结果显示:B基因型YVDD变异株均为rtM204V/rtL180M/G1896A联合变异；C基因型YVDD变异株均为rtM204V/rtL180M/rtV173L/A1762T/G1764A联合变异；C基因型YIDD变异株均为rtM204I/rtL80I/V/A1762T/G1764A和/或G1896A联合变异。(3)HBVDNA表达均为阳性；HBV DNA表达结果比较显示：变异株HBV DNA复制水平均显著高于相对应的野生株(P<0.001):C基因型YVDD变异株HBV DNA显著高于B基因型YVDD变异株(P<0.01);而C基因型YVDD变异株HBVDNA显著高于YIDD变异株(P<0.05)。(4)抗原表达与比较结果显示：1)HBsAg表达均为阳性；HBsAg表达比较结果显示:HBV不同基因型变异株HBsAg表达水平显著高于相同基因型野生株表达水平(P<0.001);C基因型YVDD变异株HBsAg显著高于B基因型YVDD变异株(P<0.001);C基因型YVDD变异株HBsAg表达水平显著高于YIDD变异株(P<0.001)。2)HBeAg表达结果显示：B基因型野生株HBeAg表达结果为阳性；B基因型YVDD变异株HBeAg表达结果为阴性；C基因型野生株与YVDD变异株HBeAg表达结果为阳性；1株C基因型YIDD变异株HBeAg表达结果显示为阳性,另2株YIDD变异株HBeAg表达结果显示为阴性。(5)构建3株HBV C基因型重组质粒。(6)建立3株HBVC基因型稳定表达细胞系。鉴定结果：1)HepG2-HBV/CM、HepG2-HBV/CV、HepG2-HBV/CI细胞株1代、10代、30代细胞外与30代细胞内HBsAg表达为阳性；HepG2-HBV/CM、HepG2-HBV/CV细胞株1代、10代、30代细胞外和30代细胞内HBeAg表达为阳性；而HepG2-HBV/CI细胞株HBeAg表达均为阴性。2)3株细胞株细胞内外HBV DNA表达均为阳性。3)拉米夫定耐药性检测表明,拉米夫定对HepG2-HBV/CM细胞株的HBV DNA表达作用敏感。4)YMDD变异类型分别为YMDD、YVDD、YIDD。5)3株细胞株内均可扩增出HBV全基因,并与原有序列一致。
结论：本研究成功构建了6株HBV B、C基因型野生株和8株HBV B、C基因型YVDD、YIDD变异株重组质粒,通过转染HepG2细胞证实了HBV不同基因型、多位点联合变异的拉米夫定耐药株在体外HBV DNA和抗原表达的差异。同时成功建立并鉴定了3株能稳定表达HBV C基因型野生型和不同拉米夫定耐药类型的稳定表达细胞株,即HepG2-HBV/CM、HepG2-HBV/CV、HepG2-HBV/CI细胞株。该研究为结合基因型深入探讨HBV拉米夫定耐药变异株的有效治疗奠定了实验基础。