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目的：①探讨不同浓度谷氨酰胺(Gln)给予不同预处理后对小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7热休克蛋白(HSP)72表达和细胞因子释放功能的影响。②观察静脉注射Gln后，脓毒症大鼠肠淋巴液对RAW264.7细胞细胞因子释放功能和人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞活力的影响。③观察大鼠肠淋巴管结扎(LDL)后，脓毒症大鼠血清对RAW264.7细胞细胞因子释放功能和HUVEC细胞活力的影响，探讨脓毒症大鼠血清对细胞的影响是否通过肠淋巴管途径。
方法：⑴共同培养2 h45 min后，加入lipopolysaccharide(LPS)刺激，于0、1、4、12和24 h收集细胞及上清液；同时行热应激预处理45 min，37℃孵育2 h后加入LPS刺激4 h，收集细胞及上清液；同时行DON预处理，2 h45 min后加入LPS刺激4 h，收集细胞及上清液。ELISA法检测细胞上清液细胞因子的浓度，Western blotting检测细胞HSP72蛋白表达。⑵采用盲肠结扎穿孔法制备大鼠脓毒血症模型，将SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、脓毒症组(CLP)、谷氨酰胺组(GLN)，并引流肠系膜淋巴液，术后即刻尾静脉注射Gln0.75 g/kg(GLN组)或等量生理盐水(Sham和CLP组)。收集术后5 h和6 h淋巴液，将不同处理组淋巴液分别与LPS激活或未激活的RAW264.7细胞共同孵育4 h，测定肠淋巴液、细胞上清液中TNF-α和IL-6的浓度，检测肠淋巴液Gln水平。将不同处理组淋巴液分别与HUVEC细胞共同孵育8 h，CCK-8法检测细胞活力，PI/Hoechst双染色观察细胞形态。⑶采用盲肠结扎穿孔法制备大鼠脓毒血症模型，将SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、脓毒症组(CLP)、肠淋巴管结扎组(CLP+LDL)。收集术后第6 h血清，将不同处理组血清分别与LPS激活或未激活的RAW264.7细胞共同孵育4 h，测定细胞上清液中TNF-α的浓度。将不同处理组血清分别与HUVEC细胞共同孵育8 h，CCK-8法检测细胞活力。
结果：①LPS刺激后4 h，RAW264.7细胞均有HSP72表达，经8 mM Gln培养者较经0和0.5 mM Gln培养者HSP72表达显著增加(P<0.01)，而24 h时三者HSP72表达差异无统计学意义(P>0.05)；Gln促进TNF-α释放，与Gln呈时间和浓度依赖关系；0.5 mM和8 mM组IL-6释放量在4h、12h较0 mM组显著增加(P<0.01)，而两组间IL-6释放量无统计学差异(P>0.05)；8 mM组IL-10释放量在12h、24h时较0 mM组显著增加(P<0.01)。②CLP组与GLN组肠淋巴液TNF-α和IL-6含量均明显高于Sham组(P<0.05)；在无LPS刺激下，三组间RAW264.7细胞释放INF-α和IL-6的差异不明显；LPS激活的RAW264.7细胞，CLP组淋巴液可显著抑制其释放TNF-α和IL-6(P<0.05)， GLN组淋巴液可部分恢复RAW264.7细胞TNF-α的释放功能(P<0.05)。三组肠淋巴液中Gln浓度没有差异。CLP组肠淋巴液可明显抑制HUVEC细胞活力(P<0.05)，GLN组肠淋巴液可部分改善其活力抑制(P<0.05)。③CLP组或CLP+LDL组血清可显著促进LPS激活或未被LPS激活的RAW264.7细胞释放TNF-α(P<0.05)。CLP组或CLP+LDL组血清均可明显抑制HUVEC细胞活力(P<0.05)。
结论：⑴Gln可诱导RAW264.7细胞表达HSP72，但并不足以抑制其TNF-α释放。除诱导HSP72表达外，Gln在脓毒症时调节机体炎症反应还可能存在其他机制。⑵脓毒症大鼠肠淋巴液对LPS激活的RAW264.7细胞释放细胞因子功能及HUVEC细胞活力有明显抑制作用，Gln能部分减轻该抑制作用。⑶脓毒症大鼠血清能促进RAW264.7细胞释放细胞因子并显著抑制HUVEC活力，而肠淋巴管结扎后并不影响脓毒症大鼠血清该作用，即脓毒症大鼠血清刺激RAW264.7细胞释放细胞因子及抑制HUVEC细胞活力的作用是通过肠淋巴管以外的途径。