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目的:百日咳是由百日咳鲍特菌感染引起的一种具有高度传染性的急性呼吸道疾病。近年来,一些疫苗接种率较高的发达国家报告百日咳发病率在多年维持较低水平后再次上升,即所谓的“百日咳再现”。因此,建立准确、快速的实验室诊断方法具有重要意义。本研究旨在建立百日咳鲍特菌两种核酸检测方法,一种是含内参的双重实时荧光重组酶介导等温扩增检测方法(Recombinase-aided amplification assay,RAA),另一种是基于锁核酸技术的一步巢式实时荧光定量PCR(locked nucleic acid(LNA)-based one-tube nested quantitative real-time PCR,LNA-OTN-q-PCR)方法,适用于不同场景,满足不同场景对快速和超灵敏的检测需求。方法:1.百日咳鲍特菌含内参的双重实时荧光RAA检测方法:本研究基于百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis,BP)的保守序列IS481基因,设计了用于检测BP的特异性引物对和探针,内参探针来源于已经发表的文章,建立了百日咳鲍特菌RAA的检测方法,并对该方法进行特异性和灵敏度评价。使用疑似百日咳的115份临床样本进行临床应用评价,每份样本分别用商业化DNA提取试剂盒和煮沸法提取核酸,采用含内参的RAA方法和文献中发表的基于IS481位点的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q-PCR)方法对每份样本的两种核酸类型进行百日咳鲍特菌的检测。2.百日咳鲍特菌LNA-OTN-q-PCR检测方法:本研究内引物和探针来源于已发表的基于BP的保守序列BP485基因的实时荧光定量PCR文献,在内引物外围设计了锁核酸修饰的外引物,建立了百日咳鲍特菌LNA-OTN-q-PCR的检测方法,并对该方法进行特异性和灵敏度评价。使用疑似百日咳的115份临床样本进行临床应用评价,每份样本分别用商业化DNA提取试剂盒和简单法提取核酸,采用基于BP485位点的LNA-OTN-q-PCR方法、文献中发表的基于BP485位点的q-PCR方法和巢式聚合酶链反应结合Real-time聚合酶链反应(nested PCR结合Real-time PCR,n PCR结合r PCR)对每份样本的两种核酸类型进行百日咳鲍特菌的检测。结果:1.本研究成功建立一种百日咳鲍特菌含内参的双重RAA检测方法。含内参的双重RAA方法检测质粒的灵敏度为10拷贝/反应。内参DNA的最佳浓度确定为100拷贝,该内参DNA的加入有效减少了假阴性的发生。与基于IS481位点的q-PCR相比,用DNA提取试剂盒提取核酸含内参的双重RAA检测方法的灵敏度和特异性均为100%。与q-PCR检测方法比较,煮沸法提取核酸含内参的双重RAA检测方法的灵敏度和特异性分别为85.96%和100%。2.本研究用一种简单快速的提取方法成功地进行了百日咳鲍特菌LNA-OTN-q-PCR检测。该方法特异性好,检测结果表明LNA-OTN-q-PCR仅对百日咳鲍特菌菌株呈阳性,其余所有菌株均为阴性。用LNA-OTN-q-PCR方法的检测灵敏度可低至1拷贝/反应,LNA-OTN-q-PCR方法的灵敏度是q-PCR方法(100拷贝/反应)的100倍。在115份临床标本中,LNA-OTN-q-PCR检测出60份阳性标本,其中q-PCR检出41份。两种提取方法(DNA提取试剂盒和简单法)的结果相同。随后,通过n PCR结合r PCR对这60份样品进行了阳性鉴定。与n PCR结合r PCR方法相比,用纯化DNA和粗提取DNA建立的LNA-OTN-q-PCR方法的特异性和灵敏度均为100%。结论:本研究建立的百日咳鲍特菌两种核酸检测技术弥补了目前核酸扩增的不足,具有现场快速和超灵敏的优势,在不同的场景具有较高的应用价值,为百日咳的病原学诊断和流行病学研究提供了可靠依据,对百日咳的防治具有重要意义。