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研究目的高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, hHcys)是导致终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)的一个重要的危险因子和致病因素。近年来研究表明,hHcys能直接作用于肾小球,诱导肾小球功能紊乱,进一步导致肾小球硬化,最终发展为终末期肾病。肾小球内皮细胞、基底膜和足细胞共同构成了肾小球的滤过屏障,其中足细胞和肾小球内皮细胞对维持肾脏功能和滤过屏障的选择通透性都具有十分重要的作用。足细胞损伤可导致蛋白尿的产生,而肾小球内皮细胞功能紊乱可介导炎症应答。但目前hHcys所致肾脏损伤特别是肾小球内皮细胞与足细胞损伤的机制尚未完全明确。颗粒蛋白前体(progranulin, PGRN)是一种自分泌生长因子,由7.5个重复的同源性富含半胱氨酸颗粒蛋白区域组成。在上皮细胞、免疫细胞、神经细胞及软骨细胞等多种细胞中广泛表达,与细胞增殖、肿瘤生长、胰岛素抵抗、神经退行性疾病、组织修复以及炎症等多种病理生理学进程密切相关。前期我们课题组研究表明,在急性肾脏损伤中PGRN能够通过抑制炎症保护肾脏,但PGRN在高同型半胱氨酸血症诱导的慢性肾病中的作用,迄今未见报道。研究表明,Wnt/β-catenin信号通路与肾脏损伤有着密切的联系,参与足细胞功能紊乱和蛋白尿形成等过程。为此,本实验拟通过体内和体外两方面来研究PGRN 在 hHcys诱导的肾脏损伤中的作用及其调控机制与Wnt/β-catenin信号通路有关。实验方法与结果1.PGRN在高同型半胱氨酸诱导的肾脏损伤中的表达使用8周龄的C57BL/6J野生雄性小鼠随机分为两组,小鼠单肾摘除一周后,无叶酸饲料(folate free diet, FF diet)喂养10周构建hHcys动物模型,正常饲料(normal diet, norm diet)作为对照。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)检测无叶酸饮食血浆总同型半胱氨酸(total homocysteine, tHcys)含量升高,证明hHcys模型构建成功。酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测尿白蛋白／肌酐比值升高；过碘酸-雪夫染色(periodic acid-schiff stain, PAS)方法对小鼠肾脏石蜡切片进行染色和透射电镜(transmission electron microscope, TEM)的方法观察肾脏足细胞损伤,hHcys模型肾脏中出现系膜基质增生,基底膜厚度不均,足突融合,提示肾脏功能障碍,肾小球出现损伤。ELISA检测血浆中PGRN水平,发现血浆中PGRN降低。通过蛋白免疫印迹(western blot, WB)免疫组织化学染色(immunohistochemistry, IHC)、免疫荧光(immunofluorescence, IF)双染验证PGRN在肾脏中表达变化和分布,在肾小球内皮细胞、足细胞和近曲小管中均有表达,在肾小球中PGRN表达降低。体外实验,使用L-型同型半胱氨酸(L-homocysteine, L-Hcys)刺激肾脏四种固有细胞肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cell, GEnC) 、肾小球足细胞(human podocyte, HPC)、系膜细胞(rat mesangial cell, RMC)及肾小管上皮细胞(human kidney 2, HK-2),结果显示PGRN在GEnC 和 HPC中呈现L-Hcys剂量依赖性降低。2. PGRN在高同型半胱氨酸血症诱导的肾脏损伤中的作用C57BL/6J野生雄性小鼠和Grn基因敲除小鼠(B6(Cg)-Grntm1.1Aidi/J)雄性小鼠随机分为四组,构建hHcys动物模型。检测血浆tHcys,尿白蛋白／肌酐比值,并进行PAS染色和透射电镜分析,结果显示,PGRN缺失不影响无叶酸饮食诱导的血浆Hcys水平的变化,但加重高同型半胱氨酸血症诱导的肾脏损伤。实时定量RT-PCR检测肾脏中炎症因子的表达、IHC检测中性粒细胞的标记物Ly6B和巨噬细胞的标记物CD68,结果显示P GRN的缺失加重hHcys导致的炎症应答及炎性细胞浸润。WB、 IF结果显示,Grn基因敲除加重了hHcys介导的肾脏组织中足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin、 podocin形态损伤,以及紧密连接蛋白occludin蛋白表达降低。体外实验,WB.IF结果显示,外源重组PGRN (recombinant PGRN, rPGRN)能逆转Hcys诱导的肾小球内皮细胞间紧密连接蛋白闭合小环蛋白1(zonula occludens-1, ZO-1)蛋白水平降低及形态的损伤。3.PGRN在保护高同型半胱氨酸血症诱导的肾脏损伤中的作用机制高同型半胱氨酸血症野生型及Grn基因敲除小鼠肾脏中的β-catenin的明显活化。体外实验中,L-Hcys能够诱导GEnC和HPC中P-catenin的活化,而加入外源rPGRN则能抑制这一作用,说明PGRN可能通过抑制Wnt/p-catenin信号通路来保护hHcy诱导的肾脏损伤。结论与创新性本研究首次发现,PGRN 在 hHcys模型肾脏中显著降低,并且在GEnC和HPC 中， PGRN呈现出Hcys剂量依赖性降低。PGRN缺失加重hHcys介导的肾小球损伤、炎症应答、炎症细胞浸润、裂孔隔膜蛋白和紧密连接蛋白破坏,从而损伤肾小球滤过屏障及肾脏功能。PGRN的保护作用可能依赖于对V Vnt/β-catenin信号通路的抑制。本研究有助于进一步阐明高同型半胱氨酸血症诱导肾损伤的病理生理学机制,为PGRN作为靶点治疗肾小球疾病提供一定的理论依据和实验基础。