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癌症,又称恶性肿瘤,作为一种严重危害人类健康和性命的疾病,是人类面临的最强大敌人之一。化学药物能通过诱导肿瘤细胞死亡来治疗癌症,是临床治疗癌症的重要方法。在研究肿瘤治疗的过程中,如何快速、低成本地从成千上万的化合物中筛选出最安全、最有效的抗肿瘤化合物一直是研究的热点。肿瘤细胞死亡的途径一般包括凋亡和坏死途径,其中,凋亡途径与癌症的发生、发展、死亡紧密相关,在人类发育及抗癌药物的筛选中扮演着重要角色。对药物诱导的肿瘤细胞凋亡进行检测,可以作为药物筛选以及判定抗肿瘤药物治疗效果的依据,在肿瘤治疗中发挥着重要作用。目前,用于筛选抗肿瘤药物及检测细胞凋亡的方法有很多,但是开发通用性好、灵敏度高、样品需求量低的药物筛选及细胞凋亡检测方法仍迫在眉睫。作为一种单分子检测技术,荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)技术恰好能适应这些要求。本论文以药物筛选和凋亡细胞检测为研究内容,利用有机荧光染料及荧光量子点(quantum dots,QDs)为探针,采用FCS、荧光成像和流式细胞(flow cytometry,FCM)等检测技术,研究建立了药物筛选和凋亡细胞检测的新方法,主要的研究工作如下:(1)建立了一种单分子FCS技术筛选药物新方法。该方法是基于待筛化合物能竞争性地与靶蛋白结合,并通过fcs技术高灵敏地区分游离荧光探针及荧光探针-靶蛋白复合物。首先,以蛋白激酶抑制剂筛选作为模型,分别建立了fcs技术测定荧光探针与靶蛋白的亲和反应及候选化合物与探针-靶蛋白竞争反应的理论模型。然后设计、合成了抗肿瘤药物达沙替尼-alexa488荧光探针,将其用于abl1激酶抑制剂的筛选,并系统性地研究了达沙替尼荧光探针与abl1蛋白的结合及解离反应过程,获得探针与abl1的平衡解离常数及解离速率分别为40nm和1.8×10-3s-1。最后,将建立的方法用于筛选候选药物,评价了六种治疗慢性髓细胞样白血病药物与abl1蛋白的解离常数,结果与文献报道值基本一致。新方法的拟合相关系数r2值大于0.986,拟合残差小于0.07;利用pdms/玻璃微孔芯片技术将样品需求量降低到1μl,r2大于0.979,拟合残差小于0.12。与现有的方法相比,我们建立的方法具有高灵敏度、通用性好、低样品需求量的优点;同时无需对待筛化合物或激酶进行标记,无需特异性底物,只需探针和靶标蛋白,即可评价待筛化合物与靶标分子的亲和力。该药物筛选方法有望成为高通量筛选小分子药物的平台。(2)构建了一种基于fcs技术检测细胞凋亡的新方法。我们建立的方法基于fcs技术能够灵敏地、选择性区分细胞凋亡后的dna片段化程度。首先,通过内插核酸染料sybrgreeni标记不同的dnamarker,利用自行构建的fcs建立了高灵敏的dna片段检测方法。然后以药物力达霉素(lidamycin,ldm)来诱导人胰腺癌细胞凋亡,分别以提取的凋亡细胞dna及细胞裂解液为样本,利用fcs检测dna的扩散行为。并分别利用单组分和多组分fcs拟合模型对dna的扩散系数进行拟合,拟合r2大于0.914,拟合残差均小于0.15。DNA的扩散系数作为非常重要的参数来区分凋亡细胞和正常细胞,实验数据显示,随着药物诱导浓度的升高,凋亡细胞数量增加,细胞DNA的片段化程度越显著,DNA的扩散时间会显著下降。进而将该方法成功地用于细胞裂解液中DNA片段的检测。建立的新方法与DNA电泳及流式细胞方法的结果基本吻合。我们建立的细胞凋亡检测方法灵敏度高、预处理简单、重现性好。由于FCS技术的共聚焦体积小于1 f L,如果利用液滴阵列技术能将样品需求量降低至纳升水平,此方法可以应用于细胞凋亡的早期检测和筛选诱导细胞凋亡药物中。(3)基于QDs标记膜联蛋白(Annexin V)特异性识别凋亡细胞的原理,采用荧光成像、FCS和FCM技术,发展了原位研究细胞凋亡的新方法。将不同表面修饰的QDs与Annexin V蛋白连接,利用凝胶柱层析分离、纯化连接复合物后,利用FCS及毛细管电泳表征荧光QDs探针。考察细胞对不同表面修饰QDs的非特异性吸附,筛选出与细胞膜非特异性吸附较小、能够准确反映细胞凋亡状态的细胞凋亡检测探针,成功地应用于流式细胞分析、荧光成像,流式细胞分析结果与市售凋亡检测试剂盒的检测结果基本一致。进而,利用FCS与扫描成像联用系统(confocal laser scanning microscopy,CLSM)研究了荧光QDs在不同细胞状态下的扩散行为,检测到探针在凋亡细胞膜上的扩散系数从0.032μm2/s到0.115μm2/s。结果表明细胞凋亡过程中荧光QDs的扩散系数会增加。与传统的有机荧光染料相比,QDs荧光探针能够灵敏、准确检测细胞凋亡程度,与FCS-CLSM联用可以用于原位研究细胞凋亡。