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背景和目的:TLR4是重要的模式识别受体,能识别病原相关分子模式,触发细胞信号的级联反应,调节免疫反应。HMGB1是损伤相关分子模式,在外界信号刺激下可释放到细胞外。HMGB1是TLR4的内源性配体,胞外的HMGB1与TLR4结合可引发胞内信号转导,介导炎症反应,HMGB1还可能是TLR4信号通路的下游分子。目前抑制TLR4对H.pylori感染过程中HMGB1/TLR4信号通路的影响未见报道,故本研究观察了抑制TLR4信号通路对H.pylori感染胃黏膜和细胞中HMGB1/TLR4的影响,以期阐明在Hp感染过程中TLR4对HMGB1的调控及TLR4和HMGB1的相互作用,并从一新的角度探索H.pylori的致病机制。方法:(一)TLR4抗体阻断对H.pylori感染的BABL/c小鼠胃黏膜组织内HMGB1和TLR4蛋白表达的影响课题组前期的BABL/c小鼠胃黏膜组织标本,实验分组如下:(1)Control组:BABL/c小鼠+IgG1(2)单纯anti-TLR4对照组:BABL/c小鼠+anti-TLR4(3)单纯Hp组:BABL/c小鼠+IgG1+H.pylori(4)Hp+anti-TLR4组:BABL/c小鼠+anti-TLR4+H.pylori(二)TAK-242对H.pylori感染的GES-1细胞HMGB1/TLR4信号通路的影响实验分组:(1)Control组:GES-1细胞(2)Hp对照组:GES-1细胞+H.pylori(3)低浓度TAK-242干预组:GES-1细胞+0.5μM TAK-242+H.pylori(4)中浓度TAK-242干预组:GES-1细胞+1.0μM TAK-242+H.pylori(5)高浓度TAK-242干预组:GES-1细胞+2.0μM TAK-242+H.pylori根据以上分组,给予不同浓度的TAK-242提前1h预处理,用H.pylori(MOI=100)感染GES-1细胞24h后收集细胞。(三)TAK-242干预H.pylori感染的GES-1细胞对共培养的THP-1细胞HMGB1/TLR4信号通路的影响1.0μM TAK-242预处理GES-1细胞1h后,用MOI=100的H.pylori感染GES-1细胞,将GES-1细胞与THP-1细胞用Transwell系统共培养24h后收集GES-1和THP-1的细胞及共培养上清,实验分组:(1)Control组:GES-1细胞+THP-1细胞(2)单纯TAK-242组:GES-1细胞+TAK-242+THP-1细胞(3)单纯Hp组:GES-1细胞+H.pylori+THP-1细胞(4)Hp+TAK-242组:GES-1细胞+TAK-242+H.pylori+THP-1细胞(四)检测方法(1)免疫组化检测BABL/c小鼠胃黏膜标本HMGB1和TLR4蛋白的表达。(2)Real-time PCR检测细胞HMGB1、TLR4、MyD88 m RNA的表达。(3)Western Blot检测细胞TLR4、MyD88、pNF-κB p65、HMGB1蛋白表达。(4)WesTM全自动蛋白表达分析系统检测细胞共培养上清中HMGB1的含量。(5)ELISA检测细胞共培养上清中TNF-α和IL-10的含量。结果:(一)TLR4抗体阻断对H.pylori感染的BABL/c小鼠胃黏膜组织内TLR4和HMGB1蛋白表达的影响⑴胃黏膜组织内腺细胞和炎症细胞TLR4蛋白的表达不管在腺细胞还是炎症细胞中,Control组和anti-TLR4对照组的TLR4表达无差异,Hp组和Hp+anti-TLR4组的TLR4表达均显著高于Control组及anti-TLR4组(P<0.001和P<0.001),Hp+anti-TLR4组的TLR4表达显著低于Hp组(P<0.01)。⑵胃黏膜组织内腺细胞和炎症细胞HMGB1蛋白的表达不管在腺细胞还是炎症细胞中,Control组和anti-TLR4对照组的HMGB1表达无差异,Hp组和Hp+anti-TLR4组的HMGB1表达均显著高于Control组及anti-TLR4组(P<0.001和P<0.01),Hp+anti-TLR4组的HMGB1表达显著低于Hp组(P<0.05)。(二)TAK-242对H.pylori感染的GES-1细胞HMGB1/TLR4信号通路的影响⑴GES-1细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达:Hp组GES-1细胞中TLR4 mRNA和蛋白的表达均显著高于Control组(P<0.05);0.5μM浓度的TAK-242干预组中TLR4 m RNA表达高于Hp组,而蛋白表达低于Hp组,但都无统计学差异(P>0.05);1.0μM和2.0μM浓度的TAK-242干预组TLR4 m RNA和蛋白表达均低于Hp组,但只有1.0μM浓度的TAK-242干预组有统计学差异(P<0.05)。⑵GES-1细胞MyD88 m RNA和蛋白的表达:Hp组GES-1细胞中MyD88 mRNA和蛋白的表达均显著高于Control组(P<0.05和P<0.01);0.5μM浓度的TAK-242干预组中MyD88 mRNA表达高于Hp组,而蛋白水平低于Hp组,都有统计学差异(P<0.05和P<0.01);1.0μM和2.0μM浓度的TAK-242干预组MyD88 mRNA和蛋白表达均低于Hp组,但只有1.0μM浓度的TAK-242干预组有统计学差异(P<0.05和P<0.01)。⑶GES-1细胞pNF-κB p65蛋白的表达:Hp组GES-1细胞中pNF-κB p65蛋白表达显著高于Control组(P<0.01);不同浓度的TAK-242干预组pNF-κB p65蛋白表达均显著低于Hp组,但只有1.0μM和2.0μM浓度的TAK-242干预组有统计学差异(P<0.05和P<0.01)。⑷GES-1细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达:Hp组GES-1细胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表达均显著高于Control组(P<0.01和P<0.05);0.5μM浓度的TAK-242干预组中HMGB1 mRNA表达显著高于Hp组(P<0.01),而蛋白表达低于Hp组(P>0.05);1.0μM和2.0μM浓度的TAK-242干预组m RNA和蛋白表达均低于Hp组,但只有1.0μM浓度的TAK-242干预组有统计学差异(P<0.01)。(三)TAK-242干预H.pylori感染的GES-1细胞对共培养THP-1细胞HMGB1/TLR4信号通路的影响⑴GES-1细胞TLR4和HMGB1蛋白的表达:Hp组GES-1细胞的TLR4和HMGB1蛋白表达显著高于control组(P<0.01),TAK-242+Hp组显著低于Hp组(P<0.01),TAK-242组与control组无差异(P>0.05)。⑵THP-1细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达:Hp组THP-1细胞的TLR4 m RNA和蛋白表达显著高于control组(P<0.05),TAK-242+Hp组显著低于Hp组(P<0.01和P<0.05);TAK-242组TLR4 mRNA和蛋白表达都低于control组,但蛋白水平的差异无统计学意义(P>0.05)。⑶THP-1细胞MyD88 m RNA和蛋白的表达:Hp组THP-1细胞的MyD88 mRNA和蛋白表达显著高于control组(P<0.01),TAK-242+Hp组显著低于Hp组(P<0.05),TAK-242组与control组无差异(P>0.05)。⑷THP-1细胞pNF-κB p65蛋白的表达:Hp组THP-1细胞的pNF-κB p65蛋白表达显著高于control组(P<0.01),TAK-242+Hp组显著低于Hp组(P<0.01),TAK-242组显著低于control组(P<0.01)。⑸THP-1细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达:Hp组THP-1细胞的HMGB1 mRNA和蛋白表达显著高于control组(P<0.01),TAK-242+Hp组显著低于Hp组(P<0.05和P<0.01);TAK-242组HMGB1 mRNA和蛋白表达都低于control组,但蛋白水平的差异无统计学意义(P>0.05)。⑹细胞共培养上清中HMGB1的含量:Hp组细胞共培养上清的HMGB1含量显著高于control组(P<0.05),TAK-242+Hp组显著低于Hp组(P<0.01),TAK-242组与control组间无差异(P>0.05)。⑺细胞共培养上清中TNF-α的含量:Hp组细胞共培养上清的TNF-α含量显著高于control组(P<0.01),TAK-242+Hp组显著低于Hp组(P<0.01),TAK-242组显著低于control组(P<0.01)。⑻细胞共培养上清中IL-10的含量:Hp组IL-10含量显著低于control组(P<0.05),TAK-242+Hp组显著高于Hp组;TAK-242组与control组间无差异(P>0.05)。结论:1、H.pylori感染能活化HMGB1/TLR4信号通路,促进胃黏膜的炎症反应。2、抑制TLR4不但可抑制H.pylori感染时TLR4信号通路的激活,同时可抑制HMGB1的表达和分泌,提示HMGB1不仅作为TLR4的配体激活TLR4信号通路,同时还可能是TLR4信号通路的下游分子,二者相互调控,形成HMGB1和TLR4信号通路的正反馈环,导致炎症反应的不断放大和加强。