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本研究将微生物学、免疫学、分子生物学和生物材料学等多个学科有机结合起来，采用基于表位的疫苗设计的方法，运用基因重组技术构建了治疗性的乙肝DNA疫苗；并对疫苗的生产工艺和质量控制标准进行了研究；辅以纳米的基因疫苗运载体统后，将制备好的疫苗纳米缓释系统免疫小鼠，初步考察疫苗激发的细胞免疫反应。本研究包括五个部分：
第一章疫苗的设计与构建
本研究是基于表位的疫苗设计(EPITOPE-BASED VACCINEDESIGN，EBVD)，以多表位基因疫苗的方式入手，构建HBV基因疫苗。首先筛选靶抗原，即通过高分辨率的表位图谱及计算机辅助设计的手段预测并筛选表位，选取一组具有较强免疫原性的多种杀伤性T细胞表位及B细胞表位，进行有机的组合；辅以一定的旁侧序列连接这些表位以保证在真核细胞中能正确表达并加工成有效的多肽片段。
pVAX1真核表达质粒是FDA批准的能用于临床试验的载体，含有丰富的CpG序列，通过化学合成得到目的基因片断，并采用限制性内切酶技术和基因重组技术将目的片断克隆入pVAX1真核表达载体，通过酶切、PCR及测序的方法鉴定目的片断已成功插入，得到重组质粒pVAX/HS，为下一步工作奠定了基础。
第二章疫苗的发酵与纯化工艺的研究
从培养基配方、pH值及溶氧等方面对发酵工艺进行优化，用层析的方法对发酵产物进行大规模纯化，以得到大量的疫苗产品来满足实验需要。
首先采用了单因素考察的实验方法，找到了适合的碳源、氮源、磷源、镁离子及较适水平，考虑到各因素间可能存在的交互影响作用，运用SAS软件安排中心组合实验并进行响应面分析，回归拟合中心组合实验数据，可以得到能与实际情况拟合良好的模型方程，进而可知最适的培养基成份。其次，在摇瓶分批发酵实验的基础上，进行补料分批发酵研究。发现溶氧与底物消耗密切相关，建立了利用溶氧反弹来确定补料时机的模式，并在20L发酵罐中进行补料分批发酵实验，采用恒速流加甘油的方式可以在一定程度上解除高浓度底物的抑制效应，提高甘油的利用率，同时使菌体处于合适的底物浓度。最后，通过分子筛与阴离子交换层析的方法，去除裂菌后质粒疫苗中的宿主RNA、开环的质粒DNA及内毒素等主要污染物。
本实验得到的携带有质粒疫苗的工程菌较适发酵培养基配方为(g/L)：甘油1.0、蛋白胨33.1、酵母抽提物5.0、KH2PO4 13.7、MgSO4.7H2O1.5。经优化后，生物量在初始培养基的基础上提高了2.8倍。采用该模式进行补料取得了良好的效果，得到生物量达69.8g/L，比批次发酵提高22％。通过层析的方法，去除了主要杂质，纯化并浓缩得到了大量的目的基因质粒。
第三章DNA疫苗质量控制的研究
作为核酸疫苗的质粒上设计有大肠杆菌复制起始位点，本实验采用大肠杆菌发酵来扩增质粒DNA，这为将来的产业化提供了可行性。核酸疫苗的生产涉及多步过程，如发酵、裂菌、柱层析分离纯化目的产物等，在制备过程中采用无菌控制，柱层析时采用注射用水作为流动相，从各个方面来尽量减少样品的污染。根据生物制品质量标准，疫苗制品的质量控制多采用生物学分析方法，检测结果的准确性远远大于物理、化学测定方法。本实验建立了准确、灵敏、简单易行的疫苗质量检定分析方法。
在进行动物试验和临床试验前还必须对质粒的含量、纯度、残余杂质进行测定，检定其是否合格，确定所制备质粒合格才能进行下一步工作。结合本核酸疫苗的发酵生产及纯化制备过程的特点，大肠杆菌是G菌，可以产生内毒素，在破菌过程又会引入宿主核酸及蛋白的污染。因此本研究从内毒素、蛋白残量、RNA、超螺旋质粒与开环质粒的比例这几个方面对疫苗质量进行控制。
第四章白蛋白纳米粒-DNA疫苗制备的研究
本实验探讨了治疗性乙肝疫苗DNA/AL-NP(DNA/白蛋白纳米粒)缓释系统的制备、性质及其介导DNA体外转染的效果。采用改进复凝聚法制备白蛋白纳米粒，首先分别从乙醇、戊二醛的浓度及固化时间单因素考察对白蛋白纳米粒粒径及分散度的影响，然后采用正交设计考察几个因素间的交互作用，发现在较优化的条件下制备的纳米粒其形态多为球形，平均粒径为160nm；从pH值及DNA与白蛋白纳米粒的配比考察包封率，使包封率达96％，并在细胞外释放具有缓释的特征，且对DNA的结构无影响；DNA/AL-NP缓释系统能在体外直接转染HEK293T细胞，并表达出相应的产物，表明对DNA的生物学活性没有影响，为下一步动物实验的研究奠定了基础。
第五章白蛋白纳米粒.乙肝DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫的研究
为了进一步证实构建的DNA疫苗的免疫学活性，以及DNA/AL-NP基因疫苗缓释系统对免疫效果的影响，我们进行了小鼠体内实验。将基因疫苗裸DNA、空白的白蛋白纳米粒、PBS缓冲液与DNA/AL-NP缓释系统多次皮下接种，对BALB/C小鼠进行免疫，通过51Cr释放实验及间接酶联免疫斑点分析实验检测CTL。结果显示DNA/AL-NP缓释系统组的免疫效果比其它组好，且差异显著，裸DNA组比空白纳米粒组及PBS缓冲液组免疫效果好，有显著性差异，空白纳米粒组与PBS缓冲液组无明显免疫效果。