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背景与目的： 鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）是我国南方常见的恶性肿瘤，中国发病率为10～30/10万，其中以广东省高发，发病率达30～50/10万，有“广东癌”之称。放疗或联合化放疗是鼻咽癌主要治疗手段，但局部复发及远处转移仍是治疗失败的主要原因，骨为最常见转移部位之一。 紫杉醇（Paclitaxel，TAX）为复发或转移性鼻咽癌的常用治疗药物，能提高疾病缓解率和局部控制率，但未能提高总生存率，合适应用方法仍未确定。 唑来膦酸（Zoledronicacid，ZOL）通过抑制肿瘤细胞的增殖、分化，诱导细胞凋亡，降低肿瘤细胞的迁移、侵袭能力，抑制肿瘤新生血管形成，刺激gdT淋巴细胞增殖等多种途径直接或间接发挥其抗肿瘤作用。本课题组先前研究发现ZOL能直接抑制人鼻咽癌HNE1肿瘤细胞的增殖，降低肿瘤细胞的迁移、侵袭能力，抑制血管形成。 临床上，唑来膦酸主要用于预防和治疗肿瘤骨转移，减少病理性骨折、脊髓压迫和高钙血症等骨相关事件（skeletal-relatedevents，SREs）发生；联合抗肿瘤药物对前列腺癌、肺癌和乳腺癌等有协同抗肿瘤作用。已有研究表明ZOL联合TAX对乳腺癌细胞系、前列腺癌细胞系、有高危骨转移肺腺癌细胞系均有协同抗肿瘤作用，但ZOL联合TAX对鼻咽癌细胞系的抗肿瘤作用及相关机制尚未有研究报道。 本研究通过体外实验研究，观察ZOL与TAX不同联合方式对人鼻咽癌HNE1细胞增殖和凋亡的影响，并探索合适的联合治疗方式及其抗肿瘤作用的相关机制，为临床上合理应用紫杉醇联合唑来膦酸治疗鼻咽癌提供理论依据。 方法 第一部分唑来膦酸联合紫杉醇不同序贯用药方案对鼻咽癌HNE1细胞作用研究 1.实验分组：①阴性对照：无加药培养72hr；②TAX单药组：TAX10nmol/L培养48hr，无加药培养基再培养24hr；③ZOL单药组：ZOL20μmol/L培养48hr，无加药培养基再培养24hr；④ZOL+TAX联合组：ZOL20μmol/L+TAX10nmol/L培养24hr，无加药培养基再培养48hr；⑤TAX序贯ZOL组：先用TAX10nmol/L培养24hr后，换用ZOL20μmol/L培养24hr，无加药培养基再培养24hr；⑥ZOL序贯TAX组：先用ZOL20μmol/L培养24hr，换用TAX10nmol/L培养24hr后，无加药培养基再培养24hr。 2.MTT法检测ZOL和TAX联合不同序贯方案对HNE1细胞的抗增殖作用。 3.流式细胞术（FCM）检测ZOL和TAX联合不同序贯方案对HNE1细胞的凋亡诱导作用。 4.原位末端标记法（TdT-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL）检测ZOL和TAX联合不同序贯方案对HNE1细胞的凋亡诱导作用。 5.实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测ZOL和TAX联合不同序贯方案对HNE1细胞Bcl-2、Bax、Caspase3和Caspase9mRNA表达的影响。 6.WesternBlot检测ZOL和TAX联合不同序贯方案对HNE1细胞Bcl-2、Bax、Caspase3和Caspase9蛋白表达的影响。 第二部分紫杉醇抗人鼻咽癌HNE1细胞增殖和凋亡作用的实验研究 1.MTT法检测不同浓度（0、2.5、5、10、20、40、80nmol/L）紫杉醇对HNE1细胞的抗增殖作用。 2.FCM检测不同浓度（0、5、10、20nmol/L）紫杉醇对HNE1细胞的早期凋亡诱导作用。 3.TUNEL检测不同浓度（0、5、10、20nmol/L）紫杉醇对HNE1细胞的诱导凋亡作用。 结果： 第一部分 1.ZOL和TAX联合不同序贯方案对HNE1细胞均有增殖抑制作用。TAX单药组、ZOL单药组、ZOL+TAX联合组、TAX序贯ZOL组和ZOL序贯TAX组对HNE1细胞的72hr抑制率分别为（33.79±4.00）％、（29.43±2.43）%、（40.69±1.99）%、（49.89±0.41）%和（62.93±2.29）%。与对照组比较，差别均有统计学意义（P﹤0.05）；其中以先用唑来膦酸后用紫杉醇作用最强，与其它各组比较，差别均有统计学意义（P﹤0.05）。 2.FCM检测HNE1细胞早期凋亡结果：对照组、TAX单药组、ZOL单药组、ZOL+TAX联合组、TAX序贯ZOL组和ZOL序贯TAX组作用HNE1细胞72hr的早期凋亡率分别为（2.59±0.28）%、（13.89±0.69）%、（11.73±0.54）%、（23.97±0.68）%、（10.45±0.16）%和（8.59±0.74）%。与对照组比较，差别均有统计学意义（P﹤0.05）。 3.TUNEL检测不同处理组诱导HNE1细胞凋亡结果：对照组、TAX单药组、ZOL单药组、ZOL+TAX联合组、TAX序贯ZOL组和ZOL序贯TAX组作用HNE1细胞72hr的凋亡指数分别为（2.33±0.58）%、（9.25±2.06）%、（6.25±1.71）%、（22.33±4.04）%、（16.75±1.50）%和（29.50±4.04）%。与对照组比较，各处理组差别均有统计学意义（P<0.05）；其中以先用唑来膦酸后用紫杉醇作用最强，与其它各组比较，差别均有统计学意义（P<0.05）。 4.RQ-PCR测定不同处理组对HNE1细胞Bcl-2、Bax、Caspase3和Caspase9mRNA表达的结果。对照组、TAX单药组、ZOL单药组、ZOL+TAX联合组、TAX序贯ZOL组和ZOL序贯TAX组处理HNE1细胞72hr的Bcl-2mRNA表达分别为（1.00±0.00）、（0.94±0.06）、（1.07±0.05）、（0.80±0.01）、（0.84±0.05）和（0.74±0.20）（P<0.05）；BaxmRNA表达分别为（1.00±0.00）、（0.92±0.03）、（1.10±0.14）、（2.23±0.04）、（2.05±0.07）和（2.55±0.06）（P<0.05）；Caspase3mRNA表达分别为（1.00±0.00）、（1.03±0.04）、（1.05±0.07）、（3.08±0.30）、（2.75±0.36）和（4.03±1.27）（P<0.05）；Caspase9mRNA表达分别为（1.00±0.00）、（0.95±0.08）、（1.17±0.38）、（2.96±0.06）、（2.90±0.42）和（3.63±0.18）（P<0.05）。与对照组相比，TAX单药组、ZOL单药组、ZOL+TAX联合组、TAX序贯ZOL组和ZOL序贯TAX组均不同程度上调促凋亡基因Bax、Caspase3、Caspase9mRNA表达，差别均有统计学意义（P<0.05）；并不同程度下调抑凋亡基因Bcl-2mRNA表达，但只有ZOL序贯TAX组差别有统计学意义（P<0.05）。 5.Westernblot测定不同处理组对HNE1细胞Bcl-2、Bax、Caspase3和Caspase9蛋白表达的结果。用Gel-ProAnalyzer4.0分析软件测量蛋白OD值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量（目的蛋白OD值/内参OD值）。对照组、TAX单药组、ZOL单药组、ZOL+TAX联合组、TAX序贯ZOL组和ZOL序贯TAX组处理HNE1细胞72hr的Bcl-2蛋白相对表达量分别为（74.57±1.39）、（91.45±3.61）、（48.73±1.53）、（86.13±5.52）、（74.00±3.87）和（60.24±1.42）（P<0.05）；Bax蛋白相对表达量分别为（2.66±0.05）、（19.09±0.60）、（51.99±2.09）、（114.41±4.50）、（71.21±4.50）和（85.89±2.1）（P<0.05）；Caspase3-32kD蛋白相对表达量分别为（7.94±0.2）、（8.94±0.40）、（14.02±0.32）、（85.49±4.51）、（62.39±3.41）和（68.08±1.61）（P<0.05）；Caspase3-17kD蛋白相对表达量分别为（3.49±0.03）、（5.63±0.19）、（17.66±0.93）、（88.01±3.49）、（33.22±0.76）和（67.77±2.36）（P<0.05）；Caspase9-47kD蛋白相对表达量分别为（1.95±0.18）、（4.24±0.26）、（74.30±1.83）、（17.39±0.45）、（6.04±0.44）和（97.95±0.73）（P<0.05）；Caspase9-37kD蛋白相对表达量分别为（1.22±0.04）、（3.56±0.23）、（63.30±1.77）、（31.17±1.83）、（17.61±0.95）和（84.72±9.90）（P<0.05）。与对照组相比，各处理组均不同程度下调抑凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax、上调并活化Caspase9（47kD和37kD）和Caspase3（32kD和17kD）蛋白表达，差别均有统计学意义（P<0.05）。Bcl-2/Bax比值分别为（28.13±0.97）、（4.79±0.06）、（0.94±0.01）、（0.75±0.02）、（1.04±0.01）和（0.70±0.01），与对照组相比，各处理组均不同程度的降低Bcl-2/Bax比值，差别均有统计学意义（P<0.05）。 第二部分 1．紫杉醇（TAX）浓度为0nmol/L、2.5nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L分别作用HNE1细胞12hr、24hr、36hr、48hr、72hr，与对照组相比，不同处理组对HNE1细胞均有增殖抑制作用（P﹤0.05）；且呈时间依赖性（P﹤0.05），而无浓度依赖性（P>0.05）。72hr增殖抑制率为65.69%～77.87%。 2．FCM检测不同浓度TAX对HNE1细胞凋亡诱导作用结果表明：不同浓度（0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L）TAX处理HNE1细胞48hr后，早期凋亡率分别（6.25±0.21）%、（9.70±0.14）%、（12.10±0.99）%和（28.05±0.35）%，组间差异均有统计学意义（P﹤0.05），呈浓度依赖关系。 3．TUNEL检测不同浓度（0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L）TAX作用HNE1细胞48hr后的凋亡指数分别为(2.33±0.58)%、(8.33±1.53)%、(9.25±2.06)%和(18.25±1.26)%，组间差异均有统计学意义（P﹤0.05），呈浓度依赖关系。 结论： 1.紫杉醇能够抑制人鼻咽癌HNE1细胞的增殖能力，诱导HNE1细胞凋亡。 2.唑来膦酸能够增强紫杉醇对人鼻咽癌HNE1细胞的增殖抑制和凋亡诱导能力，尤以先用唑来膦酸后用紫杉醇作用最强。 3.唑来膦酸联合紫杉醇通过下调抑凋亡Bcl-2mRNA和蛋白、上调促凋亡BaxmRNA和蛋白表达，上调并活化Caspase9和Caspase3mRNA和蛋白表达，诱导HNE1细胞凋亡。