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肝癌是人类最常见的癌症之一，肝癌的常规治疗方法为手术切除，给患者带来极大的痛苦，而且由于切除不彻底，存在转移和复发的风险。一旦肿瘤发生广泛的转移，目前临床常用的常规治疗手段都显得束手无策，探寻一种非手术的，针对转移性实体瘤的治疗方法，尤为迫切，肝癌的基因靶向治疗将会给肝癌患者带来福音。 双歧杆菌是一种革兰阳性专性厌氧益生菌。由于双歧杆菌能汇集在氧分压很低的肿瘤组织中心，所以双歧杆菌是一种很好的肿瘤基因靶向治疗载体。HSV-1 TK与GCV共同用药是当今最常见的肿瘤自杀基因治疗体系的组合。因此，将双歧杆菌重组 TK与 GCV联合（BFTK/GCV）治疗肝癌等实体瘤更有技术优势及临床意义。然而，天然dT和dU与野生型TK竞争性结合，减少了GCV的磷酸化从而削弱了BFTK/GCV体系的作用效果。 目的：筛选与GCV竞争性结合强，与天然脱氧核苷（dT, dU等）结合力减弱的TK突变基因，并探索双歧杆菌不同给药途径的安全性，评估重组双歧杆菌TK联合GCV（BFTK/GCV）治疗肝癌小鼠模型的效果。 方法：构建重组质粒pET32-TK、pET32-TK83，表达6×His-TK、6×His-TK83融合蛋白，表达的蛋白与dT、dU、GCV作用，代谢产物用 HPLC法检测。将质粒 pBEX-TK、pBEX-TK83电转至婴儿双歧杆菌并进行PCR验证。BFTK通过肌肉注射和尾静脉注射两种方式注入小鼠体内，观察实验动物的活动及生活状态，并取脾脏进行免疫组化分析。裸鼠腋下注射HepG2细胞，并进行肿瘤体内传代，构建裸鼠腋下肿瘤模型。药物作用后，测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。 结果：已成功构建重组质粒 pET32-TK、pET32-TK83，并表达6×His-TK、6×His-TK83融合蛋白。E83N会极大的减弱TK与dU的竞争性结合，而与dT和GCV的结合影响不大。质粒pBEX-TK成功电转至婴儿双歧杆菌中。双歧杆菌通过肌肉和尾静脉两种方式注射入小鼠体内均安全有效，且尾静脉注射安全性更好。成功构建裸鼠腋下肝癌肿瘤模型，BFTK/GCV明显抑制肿瘤的生长，治疗组和对照组肿瘤体积的差异有统计学意义。 结论：1、在E.coli BL21(DE3)中成功表达了6×His-TK、6×His-TK83融合蛋白。 2、TK83突变体比野生型TK与底物的结合更小。 3、双歧杆菌静脉注射的方式比肌肉注射引起的免疫反应更小，因此更加安全有效。