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蛋白翻译后的泛素化修饰在调节各种细胞生物功能的过程中发挥着关键的作用。近几年新发现的线性泛素链组装复合体(linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC)由HOIP、HOIL-1L和SHARPIN组成,能够产生一种新型的Met1连接的线性多聚泛素链,可以特异性调控经典的NF-κB信号通路,是天然免疫反应的重要组成部分。NLRs是一类重要的胞浆型模式识别受体(PRR),负责识别细胞内信号,是固有免疫针对病原微生物的一类重要感受器。NLRX1是NLRs家族中唯一定位于线粒体的成员,结构较为保守,能够通过多种途径参与NF-κB信号通路的调控,而NLRX1对LUBAC介导的NF-κB信号通路的调控作用尚未有人报道。因此,本论文以NLRX1为研究对象,初步探讨了其对LUBAC介导的NF-κB信号通路的影响,并进一步解释其作用机制。主要研究内容如下:1.NLRX1抑制LUBAC诱导的NF-κB启动子活化在HEK-293T细胞中,分别转染LUBAC、NF-κB-Luc、pRL-TK和不同剂量的NLRX1真核表达质粒,双荧光素酶报告系统检测发现NLRX1能够显著抑制LUBAC激活的NF-κB启动子活性,并且呈剂量依赖性。说明NLRX1能够负调控LUBAC介导的NF-κB信号通路。2.从互作角度探究NLRX1和LUBAC的关系LUBAC由HOIL-1L、HOIP和SHARPIN组成,为了探究NLRX1负调控LUBAC介导的NF-κB信号通路的作用机制,我们首先从互作角度探究NLRX1和LUBAC的关系。通过免疫共沉淀实验(CO-IP)发现,超表达条件下NLRX1与HOIL-1L、HOIP和SHARPIN均存在相互作用,但生理条件下,NLRX1只与HOIP存在互作,且NLRX1是通过其NOD结构域与HOIP的UBA结构域互作;同时还发现NLRX1能够抑制LUBAC复合物的形成,减少LUBAC对NEMO的招募。3.NLRX1发挥负调控作用的关键结构域为LRR结构域为了探究NLRX1发挥负调控作用的关键结构域,构建了NLRX1的4个截短突变体,NLRX1-N-ter(1-468bp)、NLRX1-ΔN-ter(469-2928bp)、NLRX1-LRR(976-2928bp)和NLRX1-ΔLRR(1-975bp)。用双荧光素酶报告系统分析,结果发现NLRX1的LRR结构域在负调控LUBAC依赖的NF-κB通路中发挥着重要作用。4.NLRX1对LUBAC定位及表达的影响利用间接免疫荧光实验(IFA)检测NLRX1对LUBAC定位的影响,发现NLRX1和LUBAC存在共定位且定位于胞浆,NLRX1对LUBAC的定位几乎没有影响。荧光定量PCR实验表明NLRX1也不影响LUBAC的mRNA水平;Western Blot检测发现NLRX1特异性抑制HOIP的表达,且呈剂量依赖性,但用MG132处理后,与对照组相比,HOIP的表达得到恢复,表明NLRX1介导的HOIP的降解是通过蛋白酶体途径实现的。5.NLRX1抑制NEMO的线性泛素化修饰在LUBAC介导的NF-κB信号通路中,LUBAC能够招募NEMO并对其进行线性泛素化修饰,引起IKK复合物的活化及IκBα的降解,促使NF-κB的释放和入核。为了验证NLRX1降解HOIP的生物学意义,通过免疫共沉淀实验检测NLRX1对内源性NEMO的线性泛素化的影响,结果发现NLRX1能够抑制内源性NEMO的线性泛素化修饰,进而负调控LUBAC介导的NF-κB信号通路。